朱友文 趙修南 洪 坤

(湖南金潤(rùn)藥業(yè)開發(fā)有限公司，長(zhǎng)沙，410000)

益奧源膠囊是按照中醫(yī)理論為指導(dǎo)，以主治多渴“參苓散”為基礎(chǔ)加減化裁而成的中藥方劑，以人參、茯苓、甘草、白術(shù)、黃芩等藥味組成，具有滋陰固澀、理氣健脾、益肝補(bǔ)腎、潤(rùn)燥生津之功效。本實(shí)驗(yàn)采用鏈脲酶素結(jié)合飼喂高糖高脂飼料致2型糖尿病小鼠模型，觀察益奧源膠囊對(duì)糖尿病模型小鼠的降血糖作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小鼠60只，體質(zhì)量16～18 g，雄性，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證編號(hào)SCXK(軍)2012-0004。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：室溫20～26 ℃，相對(duì)濕度20%～26%，光照良好，自由攝食和飲水。

1.1.2 藥物 益奧源膠囊由湖南金潤(rùn)藥業(yè)開發(fā)有限公司提供，為黃色粉末；鹽酸二甲雙胍片(陽(yáng)性對(duì)照藥，中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)AAG45G4)。

1.1.3 試劑與儀器 鏈脲霉素(STZ,Sigma公司生產(chǎn)，批號(hào)C8H15N307)；檸檬酸一水結(jié)晶(上海翊圣生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)C06829)；檸檬酸三鈉二水結(jié)晶(上海翊圣生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)C14879)；高糖高脂疾病模型動(dòng)物飼料塊(北京華阜康生物科技股份有限公司生產(chǎn))。AR3130奧豪斯電子天平(梅特勒托利斯多儀器(上海)有限公司)；EPS-2001電子天平(長(zhǎng)沙湘平科技開發(fā)有限公司)；1001實(shí)驗(yàn)室高剪切分散乳化機(jī)(江蘇南通克本爾混合設(shè)備有限公司)；GU00685575羅氏活力型血糖儀(德國(guó)羅氏診斷有限公司)；羅康全活力型血糖試紙(德國(guó)羅氏診斷有限公司，批號(hào)23471631)；光鏡和電鏡儀器(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 2型糖尿病小鼠模型的建立：取SPF級(jí)正常昆明雄性小鼠110只，體質(zhì)量14～16 g，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)留下10只繼續(xù)以普通飼料喂養(yǎng)作為正常對(duì)照組外，其余喂養(yǎng)高糖高脂飼料6 d后，空腹灌胃以0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 4.5)配制的鏈脲霉素30 mg/kg，隔日1次，連續(xù)6次，正常對(duì)照組同步灌胃檸檬酸緩沖液，末次灌胃后3 d，剪尾采血檢測(cè)空腹血糖水平。以空腹血糖≥10.0 mmol/L為2型糖尿病模型成功的標(biāo)志，將血糖未達(dá)標(biāo)或過(guò)高的動(dòng)物剔除，最后將造模成功的小鼠按血糖值的水平隨機(jī)分為模型對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組和益奧源膠囊小、中、大劑量組。

1.2.2 給藥方法 正常對(duì)照組，模型動(dòng)物對(duì)照組灌胃等體積的蒸餾水，0.4 mL/20 g,1次/d，陽(yáng)性藥對(duì)照組灌胃鹽酸二甲雙胍，400 mg/kg，益奧源膠囊小、中、大劑量組分別灌胃以益奧源膠囊粉末的混懸液3個(gè)劑量(3.0、6.0、12.0 g/kg)。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 不同時(shí)間定點(diǎn)稱體質(zhì)量，不同時(shí)間定點(diǎn)剪尾測(cè)空腹血糖；末次測(cè)血糖后，挑選每組接近血糖平均值的小鼠2只，取胰腺作胰島組織病理學(xué)觀察和電鏡胰島細(xì)胞學(xué)觀察。胰島病理組織切片，以電子照片的形式記錄并加以注釋說(shuō)明。

2 結(jié)果

2.1 益奧源膠囊對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響 結(jié)果顯示，益奧源膠囊小劑量組在給藥后第1周和第3周，與模型對(duì)照組比較，小劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第2周、第4周、第5周，與模型對(duì)照組比較，小劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但有增加體質(zhì)量的趨勢(shì)。益奧源膠囊中劑量組小鼠在給藥后直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束體質(zhì)量與模型對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但有增加體質(zhì)量的趨勢(shì)。益奧源膠囊大劑量組小鼠在給藥后第1周、第2周、第3周內(nèi)體質(zhì)量與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第4周、第5周、第6周體質(zhì)量與模型對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但有增加體質(zhì)量的趨勢(shì)。見表1。

2.2 益奧源膠囊對(duì)小鼠血糖水平的影響 結(jié)果顯示，益奧源膠囊小劑量組在第1周內(nèi)血糖水平與模型對(duì)照組比較，差異具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，在給藥第3周內(nèi)血糖水平與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在給藥第4周內(nèi)血糖水平與模型對(duì)照組比較，差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在給藥第2周、第5周、第6周血糖水平與模型對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但血糖水平也有下降趨勢(shì)。在給藥6周內(nèi)，益奧源膠囊中、大劑量觀察組小鼠血糖水平與模型組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但中劑量和大劑量組血糖水平均有下降趨勢(shì)。見表2。

表1 益奧源對(duì)STZ小鼠體質(zhì)量的影響

注:與正常對(duì)照組比較,*P<0.05、△P<0.01、▲P<0.001,與模型對(duì)照組比較，□P<0.05，()內(nèi)數(shù)字為動(dòng)物只數(shù)

表2 益奧源對(duì)STZ血糖水平的影響

注:()內(nèi)數(shù)字為動(dòng)物只數(shù)

圖1 組織病理學(xué)結(jié)果(光學(xué)顯微鏡)

2.3 組織病理學(xué)結(jié)果(光學(xué)顯微鏡) 末次測(cè)血糖后，挑選每組接近血糖平均值的小鼠2只，取胰腺作胰島組織病理學(xué)觀察，胰島病理組織切片，以電子照片的形式記錄并加以注釋說(shuō)明。6組實(shí)驗(yàn)中，共計(jì)12只動(dòng)物，每組2個(gè)照片。放大倍數(shù)見標(biāo)尺。其中，1-1與1-2為正常對(duì)照組，結(jié)果顯示胰島散在分布，呈圓形或橢圓形，與外分泌腺交界規(guī)整清楚，胰島細(xì)胞密度適中，細(xì)胞核清晰，細(xì)胞質(zhì)淡染，屬于正常胰島細(xì)胞；1-3與1-4為模型組，結(jié)果顯示胰島數(shù)量顯著減少，體積小，胰島細(xì)胞密度不勻，部分細(xì)胞腫脹，細(xì)胞質(zhì)空泡，部分細(xì)胞核固縮，說(shuō)明胰島細(xì)胞受到中度損傷；1-5與1-6為模型對(duì)照組，結(jié)果顯示胰島數(shù)量減少，形狀不規(guī)則，胰島細(xì)胞密度增加，少數(shù)細(xì)胞腫脹，細(xì)胞質(zhì)空泡，細(xì)胞核固縮，說(shuō)明胰島細(xì)胞通過(guò)增生來(lái)修復(fù)損傷；1-7與1-8為益奧源膠囊小劑量組，其中1-7顯示胰島數(shù)量增多，體積增大，但其形狀都不規(guī)則，胰島細(xì)胞密度呈略微或顯著增加，部分細(xì)胞腫大和核固縮，說(shuō)明胰島細(xì)胞通過(guò)增生來(lái)修復(fù)損傷；1-9與1-10為益奧源膠囊中劑量組，1-9結(jié)果顯示胰島形狀不規(guī)則，大小不勻，胰島細(xì)胞密度顯著增加，而1-10結(jié)果顯示胰島數(shù)量減少，胰島旁有淋巴細(xì)胞聚集灶，胰島細(xì)胞密度適中，細(xì)胞核固縮，這些都說(shuō)明胰島細(xì)胞出現(xiàn)了損傷修復(fù)，且局部出現(xiàn)炎性反應(yīng)；1-11與1-12為益奧源膠囊大劑量組，結(jié)果顯示胰島數(shù)量減少，胰島細(xì)胞密度適中，少數(shù)細(xì)胞輕度腫脹，細(xì)胞質(zhì)空泡，細(xì)胞核固縮，說(shuō)明胰島細(xì)胞進(jìn)行了損傷修復(fù)。見圖1。

2.4 細(xì)胞病理學(xué)結(jié)果(透射電子學(xué)顯微鏡) 末次測(cè)血糖后，挑選每組接近血糖平均值的小鼠2只，取胰腺作電鏡胰島細(xì)胞學(xué)觀察，胰島病理組織切片，以電子照片的形式記錄并加以注釋說(shuō)明。共計(jì)12只動(dòng)物，每只2個(gè)圖片。其中，2-1、2-2、2-3為正常對(duì)照組，結(jié)果顯示胰島β細(xì)胞形態(tài)規(guī)整，細(xì)胞內(nèi)分泌顆粒豐富，細(xì)胞器和細(xì)胞核結(jié)構(gòu)正常；2-4、2-5、2-6為模型對(duì)照組，結(jié)果顯示胰島β細(xì)胞內(nèi)分泌顆粒不同程度減少，出現(xiàn)無(wú)顆粒空泡，但細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常，說(shuō)明胰島β細(xì)胞受到損傷；2-7、2-8、2-9為陽(yáng)性對(duì)照組，結(jié)果顯示胰島β細(xì)胞內(nèi)分泌顆粒減少，個(gè)別線粒體結(jié)構(gòu)損傷，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)正常，說(shuō)明胰島β細(xì)胞受損，但較模型對(duì)照組減輕；2-10、2-11、2-12為益奧源膠囊小劑量組，結(jié)果顯示，2-10的胰島β細(xì)胞內(nèi)分泌顆粒明顯減少，核染色質(zhì)聚集，2-11的胰島β細(xì)胞內(nèi)分泌顆粒多，結(jié)構(gòu)基本正常，與正常對(duì)照組比較差別不大，2-12的胰島β細(xì)胞內(nèi)分泌顆粒較多，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常，但核形狀不規(guī)整，說(shuō)明這些胰島β細(xì)胞受損，但較模型對(duì)照組減輕；2-13、2-14、2-15為益奧源膠囊中劑量組，結(jié)果顯示2-13的胰島β細(xì)胞內(nèi)分泌顆粒明顯減少，2-14和2-15的胰島β細(xì)胞內(nèi)分泌顆粒較多，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)基本正常，說(shuō)明這些胰島β細(xì)胞受損，但較模型對(duì)照組減輕；2-16、2-17、2-18為益奧源膠囊大劑量組，結(jié)果顯示2-16和2-17的胰島β細(xì)胞內(nèi)分泌顆粒減少，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)基本正常，2-18的胰島β細(xì)胞內(nèi)分泌顆粒較多，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)基本正常，說(shuō)明這些胰島β細(xì)胞受損，但較模型對(duì)照組減輕。放大倍數(shù)見標(biāo)尺。見圖2。

3 討論

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是遺傳、環(huán)境等因素長(zhǎng)期作用所導(dǎo)致的一種慢性、全身性代謝疾病[1-2]，有Ⅰ型和Ⅱ型的區(qū)別[3]，是一種全球性的多因素的代謝性疾病，隨著生活水平的提高，DM已成為嚴(yán)重威脅中國(guó)人健康的慢性疾病[4]世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)2型DM將會(huì)成為全球第5大致死性疾病，其具有病程長(zhǎng)、預(yù)后差、病情反復(fù)發(fā)作、致死率和致殘率較高等特點(diǎn)[5]并且近年來(lái)糖尿病發(fā)病有年輕化趨勢(shì)[6-7]。指導(dǎo)患者合理運(yùn)動(dòng)，鼓勵(lì)患者根據(jù)自身情況，適當(dāng)運(yùn)動(dòng)，減輕體質(zhì)量，從而可降低胰島素的抵抗[8]，糖尿病是內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，可通過(guò)多種發(fā)病途徑引起血糖的升高。建立理想的糖尿病動(dòng)物模型，對(duì)深入研究糖尿病的病因、發(fā)病機(jī)制、臨床治療以及預(yù)防等至關(guān)重要。

當(dāng)前，治療糖尿病以藥物為主，藥物一般能較好控制血糖，但長(zhǎng)期服用會(huì)造成不良反應(yīng)[9]。通過(guò)飲食的早期干預(yù)[10]，是預(yù)防和控制糖尿病發(fā)生最安全有效的選擇[11]，中藥防治糖尿病有著西藥不可替代的優(yōu)勢(shì)，具有作用溫和持久、不良反應(yīng)小、可長(zhǎng)期使用等特點(diǎn)。很多用于治療糖尿病的中藥方劑中都含有黃連或其主要成分為黃連生物堿[12]的物質(zhì)。湯喜蘭等[13]研究了黃連總生物堿對(duì)糖尿病大鼠的降血糖作用，發(fā)現(xiàn)黃連總生物堿灌胃組能明顯降低其空腹血糖和糖化血清蛋白水平，同時(shí)也可顯著降低谷胱甘肽—過(guò)氧化物酶活性，從而最終可降低糖尿病大鼠的血糖。已有文獻(xiàn)報(bào)道，桑葉中生物堿組分可降低糖尿病小鼠的血糖、促進(jìn)肝糖合成、增加肝糖原及增強(qiáng)糖尿病動(dòng)物糖的貯藏能力[14]。另有研究[15]發(fā)現(xiàn)，桑葉總生物堿可以有效緩解由高血糖引發(fā)的并發(fā)癥如脾臟腫大、胸腺萎縮等，明顯降低試驗(yàn)小鼠血糖值水平，從而起到降血糖作用。

圖2 組織病理學(xué)結(jié)果(電子顯微鏡)

目前使用的動(dòng)物模型有遺傳、誘導(dǎo)獲得2種類型[16]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用STZ誘導(dǎo)的方式破環(huán)其胰島β細(xì)胞和機(jī)體胰島素分泌不足使血糖值持續(xù)穩(wěn)定升高而建立2型糖尿病小鼠[17-18]。STZ能選擇性地破壞胰島β細(xì)胞，使機(jī)體胰島素分泌減少[19-20]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定糖尿病小鼠空腹血糖值，并最終對(duì)各組篩選的2只小鼠進(jìn)行病理學(xué)組織切片觀察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示益奧源膠囊具有明顯的降血糖作用，對(duì)胰島β細(xì)胞也具有顯著的修復(fù)作用。但上述結(jié)果只是初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需要開展進(jìn)一步的、全面的、深入的實(shí)驗(yàn)研究予以證實(shí)。

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