豆思遠(yuǎn)，鄂承鈞，郭慧琳，尚立宏，楊 明，陳伯祥

（1.甘肅省動物疫病預(yù)防控制中心，蘭州 730046；2.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，平?jīng)?740000）

山羊痘是由山羊痘病毒（goat pox virus，GTPV）引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病，病羊以發(fā)熱、全身起痘、呼吸道和消化道損傷以及淋巴結(jié)腫大為特征［1］。該病的流行不但對當(dāng)?shù)仞B(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展和農(nóng)牧民造成巨大的損失，還影響國際貿(mào)易，被OIE列為必須報(bào)告的疫病，也列為我國一類動物疫病。

近年來，山羊痘疫情在世界各地尤其東亞地區(qū)呈暴發(fā)流行態(tài)勢。山羊痘基因組大小為143～147 kb，共有147個開放閱讀框（ORF），編碼密度93%，所編碼的蛋白質(zhì)含53～2 027個氨基酸不等［2］。大量研究證實(shí)，A27L蛋白是痘苗病毒細(xì)胞內(nèi)成熟病毒粒子（intracellular mature virion，IMV）重要的免疫保護(hù)抗原之一。A27L蛋白又稱融合蛋白，其能與細(xì)胞膜表面的氨基葡聚糖受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒與細(xì)胞的黏附及由病毒引起的細(xì)胞融合，參與IMV形成細(xì)胞內(nèi)包膜病毒粒子的過程；還能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的中和抗體［3-5］。基因組學(xué)研究證明，GPTV ORF112編碼產(chǎn)物與痘苗病毒A27L蛋白同源［6］。因此，筆者等推測ORF112編碼產(chǎn)物是GTPV的主要免疫保護(hù)性抗原之一，可能在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。為檢測該蛋白誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答，本文開展了山羊痘病毒ORF112基因的克隆與序列分析，為建立敏感、快速、準(zhǔn)確、簡單易行的GTPV檢測方法和ORF112蛋白的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與菌株 山羊痘毒株（GTPV-S-1）由甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所保存，并在原代綿羊睪丸細(xì)胞中培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑與載體 T4DNA連接酶、PCR試劑、Takara DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0試劑盒、pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司，SE.DNA kit（OMEGA bio-tek）購自 OMEGA公司；大腸桿菌DH5α 和 BL21（DE3）菌種購自 Solarbio。

1.2 方法

1.2.1ORF112基因的PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中收錄的GTPV基因序列，遵循引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)一對引物用于擴(kuò)增ORF112基因，上游引物P1：5’-GTTTTAAATGGACAGAGCG-3’；下游引物 P2：5’-AGATTTAAGTCCTAGTTTTTTG-3’，預(yù)期擴(kuò)增的目的片段大小492 bp。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

取200 μL病毒細(xì)胞培養(yǎng)物，用病毒DNA提取試劑盒提取病毒基因組DNA，然后取5 μL病毒基因組DNA為模板，加入 4 μL dNTP 混合物、5 μL 10×PCR buffer、上下游引物各 1 μL、0.25 μL EX Taq 酶，最后補(bǔ)水至50 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 50 s；55℃ 50 s，72℃60 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物在10 g/L的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測。

1.2.2 連接及轉(zhuǎn)化 按照Takara DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0的說明書操作，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，與pMD18-T載體相連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α。在涂有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，挑選單個菌落接入含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，提取質(zhì)粒DNA樣本，經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測后將重組質(zhì)粒送大連寶生物工程有限公司測序。

1.2.3 序列分析 應(yīng)用DNAStar、BLAST（NCB I）軟件與GenBank登錄的相應(yīng)序列進(jìn)行比較，分析不同來源山羊痘病毒株ORF112基因核苷酸序列的同源性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增及初步鑒定

采用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從山羊痘病毒感染細(xì)胞培養(yǎng)物的核酸樣本中擴(kuò)增出1條約500 bp大小的DNA條帶，而正常細(xì)胞顯現(xiàn)陰性反應(yīng)，與預(yù)期大小相符合（圖1）。

圖1 ORF112擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

2.2 PCR產(chǎn)物克隆與重組質(zhì)粒鑒定

從瓊脂糖凝膠中回收PCR產(chǎn)物，與pMD18-T載體相連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α。挑選LB培養(yǎng)基上耐Amp菌落提取質(zhì)粒DNA樣本，PCR擴(kuò)增鑒定，得到約492 bp條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2）。

圖2 ORF112重組表達(dá)質(zhì)粒PCR產(chǎn)物電泳

2.3 ORF112基因核苷酸序列測定及同源性分析

將鑒定的重組質(zhì)粒送大連寶生物工程有限公司測序，山羊痘病毒的ORF112基因均為492 bp。將此ORF112基因核苷酸序列與國內(nèi)外不同來源羊痘病毒株的相應(yīng)序列進(jìn)行比較，結(jié)果見圖3。

圖3 ORF112基因核苷酸序列比對

山羊痘毒株（GTPV-S-1）的ORF112基因序列與不同來源的山羊痘病毒分離株比較，ORF112基因核苷酸序列的同源性達(dá)到86.8%以上。同源性分析結(jié)果表明，山羊痘病毒的ORF112基因具有高度保守性。

3 討論

山羊痘病毒在病毒形態(tài)、理化特性和血清學(xué)反應(yīng)上與綿羊痘病毒和牛疙瘩皮膚病病毒沒有區(qū)別，均屬于羊痘病毒屬，主要是按照易感宿主劃分的［1］。

早期研究發(fā)現(xiàn)，羊痘病毒IMV囊膜上的P32蛋白是一個重要的免疫保護(hù)性抗原，接種重組P32蛋白的動物可以產(chǎn)生特異性的中和抗體，并能部分抵御強(qiáng)毒攻擊。近年來基于痘苗病毒的大量研究發(fā)現(xiàn)，A27L、L1R等其他IMV囊膜蛋白以及B5R、A33R等胞外包膜病毒粒子（EEV）表面的囊膜蛋白在痘病毒免疫中同樣發(fā)揮著重要作用，因此，研究者也逐漸將注意力轉(zhuǎn)移到GTPV IMV和EEV的其他囊膜蛋白。作為IMV囊膜上另外一個重要的蛋白質(zhì)，A27L可以誘導(dǎo)針對IMV的高水平中和抗體和淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，免疫A27L蛋白的小鼠可以抵御痘苗病毒的攻擊。由于GTPV ORF112編碼產(chǎn)物與痘苗病毒A27L蛋白同源［2］，推測它也是GTPV的一個關(guān)鍵免疫保護(hù)性抗原，在GTPV的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。

本試驗(yàn)對所保存的山羊痘毒株（GTPV-S-1）的ORF112基因進(jìn)行測序，其核苷酸序列與不同來源的山羊痘分離株的同源性達(dá)86.8%以上，顯示了山羊痘病毒ORF112基因的高度保守性。這為進(jìn)一步研究山羊痘病毒ORF112基因的表達(dá)及其免疫原性、結(jié)構(gòu)與功能奠定了基礎(chǔ)。

［1］殷震，劉景華.動物病毒學(xué)［M］.2版.北京：科學(xué)出版社，1997：960-963.

［2］Tulman E R，Afonso C L，Lu Z，et al.The genomes of sheeppox and goatpox viruses［J］.J Virol，2002，76（12）：6054-6061.

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［4］Hooper J W，Custer D M，Thompson E.Four-gene-combination DNA vaccine protects mice against a lethal vaccinia virus challenge and elicits appropriate antibody responses in nonhuman primates［J］.Virology，2003，306（2）：181-195.

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