范家同，孫作剛，許朋斐，顏 衛(wèi)，曾 周

(1.新疆天富陽(yáng)光生物科技有限公司，新疆石河子 832000；2.新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，新疆烏魯木齊 830000)

硫酸黏菌素，又稱多黏菌素E，為多黏菌素E1、E2和E1-2硫酸鹽的復(fù)合物。它是由小山康夫在1950年從福島縣土壤中分離到的多黏芽孢桿菌抗敵素變株(Bacilluspolymyxavar．colistinus)產(chǎn)生的，是一種鎖環(huán)狀堿性多肽類抗生素，對(duì)革蘭氏陰性桿菌如銅綠假單孢菌、鼠傷寒桿菌和痢疾志賀氏菌等有強(qiáng)烈的毒殺作用。其原理如下：硫酸黏菌素中含有帶陽(yáng)電荷的親脂和疏脂基團(tuán)，與革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜中的帶負(fù)電荷的磷脂基團(tuán)反應(yīng)，引起細(xì)胞膜張力降低和通透性的改變，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物如嘌呤、核苷酸和蛋白等漏出胞外，不能按照正常的調(diào)控機(jī)制進(jìn)出細(xì)胞內(nèi)外，導(dǎo)致細(xì)胞代謝異常，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡[1-11]。淀粉作為碳源能提高發(fā)酵液中的多黏類芽孢桿菌菌體濃度[12-13]，同時(shí)淀粉相比葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖等碳源，是菌體最適碳源和產(chǎn)多黏菌素E量最高的碳源[14]。在微生物發(fā)酵中碳源一般選擇葡萄糖，即使使用淀粉作為碳源，也是直接投入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中使用，很少采用雙酶法水解淀粉用于抗生素發(fā)酵。筆者使用淀粉和葡萄糖作為復(fù)合碳源，通過雙酶法水解淀粉控制還原糖的含量，旨在提高發(fā)酵水平，為指導(dǎo)大生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源。多黏類芽孢桿菌由天富陽(yáng)光生物科技有限公司菌種組提供。

1.1.2培養(yǎng)基。種子罐培養(yǎng)基:大豆餅粉1.50%，硫酸銨1.90%,七水硫酸亞鐵0.02%，大豆油1.00%，泡敵0.02%，磷酸二氫鉀0.35%。

原發(fā)酵培養(yǎng)基:大豆餅粉1.50%，硫酸銨1.90%,玉米蛋白粉0.50%，七水硫酸亞鐵0.02%，大豆油1.00%，泡敵0.02%，磷酸二氫鉀0.35%。

現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)基:大豆餅粉1.50%，硫酸銨1.90%,玉米蛋白粉0.50%,玉米淀粉2.00%，七水硫酸亞鐵0.02%，大豆油1.00%，泡敵0.02%，磷酸二氫鉀0.35%，淀粉酶0.04%，糖化酶0.01%。

1.1.3主要儀器設(shè)備。百倫發(fā)酵罐(BLB10-15SJ-50SJ-50SJ)，上海百倫生物科技有限公司;滅菌鍋(XG1.Y型)，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司;電子秤(LT202E和LT5001E 型電子天平)，常熟市天量?jī)x器有限公司;島津高效液相色譜儀(SPD-20A)。

1.2方法

1.2.1種子罐消毒和培養(yǎng)。在不銹鋼桶里投入大豆餅粉、硫酸銨、七水硫酸亞鐵和磷酸二氫鉀，充分溶解后，倒入種子罐，再加入大豆油和泡敵，定容體積至14.5 L,消后體積16.0 L，消毒(120～122 ℃，30 min)。

種子罐培養(yǎng)條件：(33±1)℃，攪拌(300±20)r/min,風(fēng)量(0.25±0.05)m3/h,罐壓(0.03±0.01)MPa。

1.2.2發(fā)酵罐消毒和培養(yǎng)。

1.2.2.1原發(fā)酵配方消毒。在不銹鋼桶里溶解大豆餅粉、玉米蛋白粉、硫酸銨、七水硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀，加入大豆油和泡敵，定容體積至29.0 L,消后體積32.0 L，消毒(120～122 ℃，30 min)。

1.2.2.2現(xiàn)發(fā)酵配方消毒。淀粉加酶不液化和糖化:在不銹鋼桶里加入玉米淀粉、淀粉酶、糖化酶、豆餅粉、玉米蛋白粉、硫酸銨、七水硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀，溶解充分后，倒入發(fā)酵罐，加入大豆油和泡敵，定容體積至29.0 L,消后體積32.0 L，消毒(120～122 ℃，30 min)。

淀粉加酶液化和糖化20 min:在不銹鋼桶里加入玉米淀粉和淀粉酶，溶解充分后，倒入發(fā)酵罐，加水定容至10.0 L，升溫至80.0～84.0 ℃，保溫液化20 min，降溫到60.0～62.0 ℃，加入糖化酶，保溫糖化20 min，升溫至100 ℃滅活糖化酶10 min。淀粉糖化后，加入溶解好的豆餅粉、玉米蛋白粉、硫酸銨、七水硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀，再加入大豆油和泡敵，定容體積至28.0 L,消后體積32.0 L，消毒(120～122 ℃，30 min)。

淀粉加酶液化和糖化40 min:在不銹鋼桶里加入玉米淀粉和淀粉酶，溶解充分后，倒入發(fā)酵罐，加水定容至10.0 L，升溫至80.0～84.0 ℃，保溫液化40 min，降溫到60.0～62.0 ℃，加入糖化酶，保溫糖化40 min，升溫至100 ℃滅活糖化酶10 min。淀粉糖化后，加入溶解好的豆餅粉、玉米蛋白粉、硫酸銨、七水硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀，再加入大豆油和泡敵，定容體積至28.0 L,消后體積32.0 L，消毒(120～122 ℃，30 min)。

淀粉加酶液化和糖化60 min:在不銹鋼桶里加入玉米淀粉和淀粉酶，溶解充分后，倒入發(fā)酵罐，加水定容至10.0 L，升溫至80.0～84.0 ℃，保溫液化60 min，降溫到60.0～62.0 ℃，加入糖化酶，保溫糖化60 min，升溫至100 ℃滅活糖化酶10 min。淀粉糖化后，加入溶解好的豆餅粉、玉米蛋白粉、硫酸銨、七水硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀，再加入大豆油和泡敵，定容體積至28.0 L,消后體積32.0 L，消毒(120～122 ℃，30 min)。

1.2.3消后還原糖測(cè)定。發(fā)酵液的消后還原糖含量檢測(cè)采用碘量法[15]。

1.2.4種子罐移種和發(fā)酵培養(yǎng)。種子罐培養(yǎng)24 h左右，菌體較粗壯，菌量較多時(shí)移種,移種量3 L。

發(fā)酵培養(yǎng)條件：(34±1)℃，攪拌(300±50)r/min,風(fēng)量(1.00±0.20)m3/h,罐壓(0.03±0.01)MPa。

發(fā)酵罐接種后補(bǔ)加35%的葡萄糖溶液至還原糖含量為10 g/L，當(dāng)還原糖低于6 g/L時(shí)開始補(bǔ)糖。發(fā)酵過程補(bǔ)加35%的葡萄糖溶液，控制還原糖范圍：0～10 h為6～10 g/L，10～24 h為4～6 g/L，24～90 h為2～4 g/L。

1.2.5硫酸黏菌素效價(jià)測(cè)定。使用高效液相色譜技術(shù)測(cè)定發(fā)酵罐的硫酸黏菌素效價(jià)。

色譜條件：色譜柱 C18，柱溫 30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm，進(jìn)樣量 20 μL，運(yùn)行時(shí)間 30 min。

試劑配制：①混合溶劑。將水∶己腈按4∶1混合，過濾，待用。②參比溶液。將25.0 mg標(biāo)準(zhǔn)品用混合溶劑溶解并定容至50 mL。③樣品溶液。取濾液2.5 mL,置50 mL容量瓶中，用純化水稀釋至刻度。

檢測(cè)方法：首先進(jìn)樣參比溶液2針，記錄相關(guān)峰面積，再進(jìn)樣樣品溶液1針，記錄相關(guān)峰面積。計(jì)算公式如下：

總含量(μg/mL)=E1含量+E2含量

2 結(jié)果與分析

2.1種子液移種前的涂片圖1是種子液培養(yǎng)24 h的移前涂片?？梢钥闯鼍w粗壯、菌形均勻整齊、菌量較多，表明種子液的質(zhì)量很好，是較好的移種時(shí)機(jī)[16]。

圖1 種子液的涂片F(xiàn)ig.1 The smear of seed broth

2.2發(fā)酵結(jié)果對(duì)原配方以及現(xiàn)配方加酶處理0、20、40和60 min的還原糖和發(fā)酵效價(jià)做曲線，如圖2所示。

圖2 還原糖含量和發(fā)酵水平曲線Fig.2 The curves of reducing sugar content and fermentation level

從圖2可以看出，原配方和加酶沒有處理的現(xiàn)配方的還原糖含量為0.1 g/L，說明原配方基本不含還原糖，沒有升溫處理的現(xiàn)配方，由于處理時(shí)間和溫度不夠，也沒有還原糖?，F(xiàn)配方加酶處理時(shí)間越長(zhǎng)，水解的還原糖量越高，水解60 min(9.2 g/L)>水解40 min(6.9 g/L)>水解20 min(5.3 g/L)。說明淀粉水解需要一定的作用時(shí)間。加淀粉的發(fā)酵水平高于原配方發(fā)酵水平：20 min時(shí)21 178 μg/mL、40 min時(shí)20 651 μg/mL、60 min時(shí)20 230 μg/mL和0 min時(shí)20 146 μg/mL均大于原配方(19 750 μg/mL)，說明淀粉能夠提高發(fā)酵水平。現(xiàn)配方加酶處理的時(shí)間不同，發(fā)酵水平也不同：20 min(21 178 μg/mL)>40 min(20 651 μg/mL)>60 min(20 230 μg/mL)>0 min(20 146 μg/mL)。說明淀粉的水解程度影響發(fā)酵水平。

3 結(jié)論與討論

近年來，隨著對(duì)碳源的研究，很多研究報(bào)道淀粉可以提高硫酸黏菌素的發(fā)酵液菌濃度和發(fā)酵水平，但是沒有后續(xù)的研究，這些技術(shù)手段很難推廣到發(fā)酵大生產(chǎn)中。而該試驗(yàn)的小試罐發(fā)酵控制條件和大生產(chǎn)緊密聯(lián)系，數(shù)據(jù)和方法可以作為大生產(chǎn)的依據(jù)，對(duì)大生產(chǎn)來說，具有較好的指導(dǎo)意義。

通過對(duì)比原配方和加酶沒有處理的現(xiàn)配方的還原糖含量，說明原配方中基本不含還原糖。雖然原配方中的玉米蛋白粉含15%左右的淀粉[17]，但是由于沒有加酶液化，所以沒有還原糖水解出來。而加淀粉的配方由于升溫速度很快，很短的時(shí)間就超過100 ℃，酶的活性降低和失活[18]，淀粉也沒有水解。

現(xiàn)配方加酶處理時(shí)間越長(zhǎng)，水解出的還原糖量越高，驗(yàn)證了張劍等[19]的雙酶法水解淀粉里提到的處理20～120 min的還原糖含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而產(chǎn)量增加。

加淀粉的發(fā)酵水平高于原配方發(fā)酵水平，說明淀粉可以提高發(fā)酵水平。孫仲奇等[14]研究了葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖和可溶性淀粉等碳源對(duì)多黏菌素E合成的影響，結(jié)果表明：最終發(fā)酵水平由高到低依次是淀粉、乳糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖。同時(shí)王成迎[20]的硫酸黏桿菌素菌種選育與發(fā)酵工藝研究顯示，淀粉可以提高菌濃度，使用淀粉和葡萄糖復(fù)合碳源對(duì)抗生素的合成有利。淀粉配合葡萄糖是最佳的復(fù)合碳源，葡萄糖可以促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)和初級(jí)代謝，為次級(jí)代謝提供前提物質(zhì)，而淀粉可以降低葡萄糖的阻遏效應(yīng)，提高和延長(zhǎng)次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成量[21]。

現(xiàn)配方加酶處理時(shí)間不同，發(fā)酵水平也不同。原因可能是還原糖量不同，對(duì)應(yīng)發(fā)酵水平不同。劉鐵軍等[22]研究了葡萄糖濃度對(duì)桿菌肽發(fā)酵過程的影響，結(jié)果表明：在基礎(chǔ)料中葡萄糖含量為5 g/L時(shí)，發(fā)酵前期菌體生長(zhǎng)較快，且發(fā)酵液中的乙酸(發(fā)酵中大量葡萄糖存在時(shí)，會(huì)產(chǎn)生乙酸，對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成起抑制作用)累積較少，最終菌量較低，后期桿菌肽產(chǎn)生速度較慢，最終產(chǎn)量很低；當(dāng)基礎(chǔ)料中葡萄糖含量為10 g/L時(shí)，菌量較高，發(fā)酵液中的乙酸積累較少，同時(shí)中后期的桿菌肽的產(chǎn)量合成速度較快，最終的桿菌肽產(chǎn)量較高；當(dāng)基礎(chǔ)料中葡萄糖含量15或20 g/L時(shí),菌量較高，但是發(fā)酵液中的乙酸累積也較多，乙酸過多反而抑制菌體合成桿菌肽，影響最終的產(chǎn)量。雖然兩者的發(fā)酵產(chǎn)物不同，但是試驗(yàn)現(xiàn)象相似，與該試驗(yàn)的結(jié)果也基本一致。試驗(yàn)中用酶處理20 min的消后培養(yǎng)基的還原糖含量為5.3 g/L，接種后補(bǔ)至10.0 g/L，最后的發(fā)酵水平最高，效價(jià)為21 178 μg/mL。處理0 min的消后培養(yǎng)基的還原糖含量為0.1 g/L，效價(jià)最低，為20 146 μg/mL。原因可能是接種后補(bǔ)充到10.0 g/L后，較高濃度的葡萄糖濃度在代謝中產(chǎn)生了糖代謝阻遏效應(yīng)，抑制了硫酸黏菌素合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和酶的活性，導(dǎo)致合成受阻，最終效價(jià)偏低。另一方面，淀粉的利用率有限，當(dāng)基礎(chǔ)料中有葡萄糖存在時(shí)，優(yōu)先利用葡萄糖。因?yàn)槠咸烟鞘撬傩荚?，只有?dāng)葡萄糖被利用后，淀粉這類的遲效碳源才會(huì)被利用。微生物的細(xì)胞經(jīng)濟(jì)學(xué)假說認(rèn)為，在微生物的代謝活動(dòng)中，存在著以最少的耗費(fèi)獲得最大的經(jīng)濟(jì)效益現(xiàn)象。該試驗(yàn)中菌體如果要利用淀粉，則需要分泌分解淀粉的一系列酶，最后轉(zhuǎn)化為葡萄糖再利用，從而浪費(fèi)了能量。處理40和60 min的消后培養(yǎng)基的還原糖含量分別為6.9和9.2 g/L，效價(jià)分別為20 651和20 230 μg/mL。雖然接種后，通過補(bǔ)糖，還原糖含量為10.0 g/L，但是效價(jià)偏低。原因是淀粉酶解過程的產(chǎn)物不是單一的葡萄糖，還有麥芽糖，麥芽糖也是還原糖，所以最終的葡萄糖含量達(dá)不到10.0 g/L，造成效價(jià)偏低。而20 min的還原糖含量偏低，加上補(bǔ)充的葡萄糖，發(fā)酵液中的葡萄糖含量高于處理40和60 min的葡萄糖含量，更接近于文獻(xiàn)中的10.0 g/L，所以發(fā)酵水平最高。處理40 min的發(fā)酵水平比60 min高一些，也是這個(gè)原因。

因此，淀粉可以提高發(fā)酵水平，配合葡萄糖是最佳的復(fù)合碳源。同時(shí)控制淀粉水解時(shí)間20 min,還原糖含量5.3 g/L的發(fā)酵水平最高。

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