史瑋煬， 劉 洋， 韓逸超， 鄭丹丹， 戴爾寬， 鄭 冰， 李 敏

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200127）

肺炎克雷伯菌為臨床常見(jiàn)的革蘭陰性菌，是引起醫(yī)院感染的主要致病菌之一。目前臨床使用碳青霉烯類抗菌藥物治療肺炎克雷伯菌所致感染，但隨著此類藥物的廣泛使用，肺炎克雷伯菌對(duì)其耐藥性不斷增強(qiáng)。許多國(guó)家均已發(fā)現(xiàn)耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenemresistant Klebsiella pneumoniae， CRKP）菌株[1]，近年來(lái)我國(guó)肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性也呈逐年增強(qiáng)的趨勢(shì)，給臨床治療帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)[2]。本研究對(duì)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院分離的CRKP的耐藥性及同源性進(jìn)行分析，旨在為CRKP感染的臨床治療和醫(yī)院感染控制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源及鑒定

受試菌株為上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科于2013年1月—2015年8月從臨床樣本中分離的CRKP（107株）。樣本來(lái)源為痰液、血液、引流液、中段尿、膽汁、咽拭和膿液樣本。

1.2 質(zhì)控菌株

藥物敏感性試驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌（ATCC 25922），聚合酶連反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）質(zhì)控菌株為肺炎克雷伯菌 （ATCC 700603），均購(gòu)自上海市臨床檢驗(yàn)中心。

1.3 試劑及儀器

血瓊脂平板購(gòu)自美國(guó)BD公司。藥物敏感性紙片、水解酪蛋白胨平板購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司。PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。SeaKem GOLD瓊脂糖粉購(gòu)自美國(guó)Lonza公司，GelRed核酸染料購(gòu)自美國(guó)Biotium公司，脈沖場(chǎng)電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.4 細(xì)菌分離鑒定與體外藥物敏感性試驗(yàn)

細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第3版）的要求進(jìn)行。采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI）推薦的紙片擴(kuò)散法測(cè)定受試菌株對(duì)亞胺培南、厄他培南、阿米卡星、青霉素、氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、哌拉西林、頭孢唑啉、頭孢克洛、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑、磷霉素、頭孢哌酮-舒巴坦、哌拉西林和頭孢吡肟的敏感性。采用微量肉湯稀釋法測(cè)定美羅培南和替加環(huán)素的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）并判定敏感性。紙片擴(kuò)散法及美羅培南的MIC測(cè)定結(jié)果參照CLSI 2015年標(biāo)準(zhǔn)判讀[3]。替加環(huán)素的MIC測(cè)定結(jié)果參照美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局（U. S. Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）判定折點(diǎn)[4]判讀。

1.5 碳青霉烯酶耐藥基因的擴(kuò)增

采用煮沸法提取107株菌株DNA，參照文獻(xiàn)[5-7]選取引物、PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，擴(kuò)增碳青霉烯酶耐藥基因（blaKPC-2、blaOXA-48、blaVIM-1、blaVIM-2、blaIMP-1、blaIMP-2、blaNDM-1）。檢出陽(yáng)性基因的菌株取1株測(cè)序確認(rèn)，并將其作為陽(yáng)性對(duì)照，將質(zhì)控菌株肺炎克雷伯菌 （ATCC 700603）作為陰性對(duì)照。引物序列見(jiàn)表1。

1.6 PFGE

從水解酪蛋白胨平板上挑取已培養(yǎng)過(guò)夜的純菌落，用1 mL細(xì)菌懸浮液混勻，吸取200 μL加入10 μL蛋白酶K。取0.1 g SeaKem GOLD瓊脂糖粉加入10 mL三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（methylaminomethane-ethylenediaminetetraacetic acid，TE）緩沖液，54 ℃水浴30 min。將膠與菌懸液混合，加入模具中制備膠塊，使用含蛋白酶K的細(xì)胞裂解液消化4 h，棄去細(xì)胞裂解液，用預(yù)熱至55 ℃的超純水和TE緩沖液各洗3次，每次15 min。棄去液體，切下2 mm膠塊，加入含ApaI的酶切緩沖液100 μL，37 ℃酶切3 h。棄去酶切緩沖液，加入0.5×三羥甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸（methylaminomethane-boric acid-ethylenediaminetetraacetic acid，TBE）緩沖液200 μL。用0.5×TBE緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠，把包埋有細(xì)菌的膠塊放入梳孔中。將膠塊至于電泳儀中進(jìn)行脈沖場(chǎng)電泳，電泳條件：相對(duì)分子質(zhì)量30 000～600 000，6 V/cm，脈沖時(shí)間5～20 s，14 ℃，電場(chǎng)角度120°，總時(shí)間為19 h。電泳結(jié)束后，使用GelRed核酸染料染色膠塊。將膠塊置于凝膠成像系統(tǒng)中成像，并轉(zhuǎn)換成圖像格式保存。

表1 耐藥基因PCR擴(kuò)增的相應(yīng)引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用NTSYS（2.1）軟件中UPGMA算法進(jìn)行聚類分析，得到聚類圖。將具有85%以上相同條帶（相關(guān)系數(shù)＞0.85）的菌株歸入同一型別[8]。

2 結(jié)果

2.1 樣本種類與病區(qū)分布

2013年1月—2015年8月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院共分離1 821株肺炎克雷伯菌，其中CRKP 107株（5.9%）。樣本來(lái)源包括痰液（62.6%，67/107）、血液（11.2%，12/107）、引流液（11.2%，12/107）、中段尿（9.4%，10/107）、膽汁（2.8%，3/107）、咽拭（1.9%，2/107）和膿液（0.9%，1/107）。107株CRKP分離病區(qū)居前3位的分別為神經(jīng)外科（18.7%，20/107）、外科重癥監(jiān)護(hù)病房（intensive care unit，ICU）（18.7%，20/107）和普外科（15.9%，17/107）。見(jiàn)表2。

表2 各病區(qū)CRKP分布及PFGE分型結(jié)果

2.2 耐藥性檢測(cè)

微量肉湯稀釋法測(cè)定MIC的結(jié)果顯示，在107株CRKP中對(duì)美羅培南耐藥的菌株占99.1%（106/107），中介的菌株占0.9%（1/107），敏感的菌株占0.0%（0/107），對(duì)替加環(huán)素耐藥的菌株占0.0%（0/107），中介的菌株占0.0%（0/107），敏感的菌株占100.0%（107/107）。紙片擴(kuò)散法結(jié)果顯示，受試菌株對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑（29.0%）和磷霉素（74.7%）的耐藥率最低，對(duì)青霉素、氨芐西林、哌拉西林、頭孢唑啉、頭孢克洛、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、亞胺培南及厄他培南的耐藥率為100.0%，對(duì)阿米卡星、頭孢哌酮-舒巴坦、氨芐西林-舒巴坦、環(huán)丙沙星及哌拉西林的耐藥率均＞95.0%。見(jiàn)表3。

表3 107株CRKP對(duì)20種抗菌藥物的耐藥情況

2.3 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

在107株CRKP中檢出blaKPC-2基因陽(yáng)性率為100.0%（107/107），blaIMP-1基因陽(yáng)性率為0.9%（1/107），未檢測(cè)出blaOXA-48、blaVIM-1、blaVIM-2、blaIMP-2和blaNDM-1基因。

2.4 PFGE結(jié)果

107株CRKP經(jīng)PFGE得到電泳圖譜，部分結(jié)果見(jiàn)圖1。經(jīng)NTSYS（2.1）軟件分析得出聚類圖（圖2）。將具有85%以上相同條帶（相關(guān)系數(shù)＞0.85）的菌株歸入同一帶型，107株CRKP被分為24個(gè)型別：A型[19.6%（21/107）]、B型[13.1%（14/107）]、C型[11.2%（12/107）]、D型[8.4%（9/107）]、E型[5.6%（6/107）]、F型[5.6%（6/107）]、G型[5.6%（6/107）]、H型[4.7%（5/107）]、I型[4.7%（5/107）]、J型[3.7%（4/107）]、K型[3.7%（3/107）]、L型[3.7%（3/107）]、M型[1.9%（2/107）]和N～X型各1株。A型、B型、C型為主要型別。A型21株菌株主要來(lái)自神經(jīng)外科（38.1%，8/21）。B型14株菌株主要來(lái)自神經(jīng)外科（28.6%，4/14）和急診內(nèi)科留觀室（28.6%，4/14）。C型12株菌株，分別分離自6個(gè)病區(qū)（表2）。在107株CRKP中，27株分離自無(wú)菌體液（包括血液12株、引流液12株和膽汁3株），含A型5株（18.5%）、C型4株（14.8%）、D型3株（11.1%）、F型3株（11.1%）、B型2株（7.4%）、E型2株（7.4%）、G型2株（7.4%），H型2株（7.4%）及I、M、O和U型各1株。

微量肉湯稀釋法，結(jié)果顯示替加環(huán)素耐藥CRKP共36株，包括A型7株，F(xiàn)型6株，C型4株，B型3株，D、E、H和M型各2株，G、I、J、O、P、Q和X型各1株。

21株A型CRKP中有15株（71.4%）分離于1個(gè)月內(nèi)（2015年5月29日—6月29日），其中神經(jīng)外科6株、門(mén)診3株、血液科2株、老年科2株、外科ICU 1株和泌尿外科1株。在6株F型CRKP中有4株分離于2周內(nèi)（2015年4月2—15日），普外科和老年科各2株。其余22型（B～E型，G～X型）共80株CRKP均散發(fā)于不同時(shí)期和不同病區(qū)，離散性較大。

圖1 部分CRKP的PFGE電泳圖

圖2 107株CRKP的PFGE聚類分析圖

3 討論

碳青霉烯類抗菌藥物可以有效治療肺炎克雷伯菌感染，但臨床不合理應(yīng)用抗菌藥物使耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌數(shù)量逐年增加。AGODI等[9]報(bào)道CRKP檢出率由2008年的0.0%增加至2013年的59.2%。CRKP的耐藥機(jī)制包括產(chǎn)抗菌藥物滅活酶、使抗菌藥物滲透障礙（生物被膜和外膜膜孔蛋白缺失）、基因變異導(dǎo)致藥物作用靶位改變、主動(dòng)外排泵系統(tǒng)的亢進(jìn)作用等[10]。同時(shí)CRKP也可對(duì)β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類等抗菌藥物產(chǎn)生耐藥。

目前國(guó)內(nèi)外臨床治療CRKP選用的一線藥物包括碳青霉烯類、頭孢類（第3代、第4代）和喹諾酮類等抗菌藥物，二線藥物包括替加環(huán)素、多黏菌素類、磺胺類和氨基糖苷類等抗菌藥物[11]。國(guó)內(nèi)外對(duì)CRKP耐藥性的研究顯示，CRKP對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑、替加環(huán)素和阿米卡星的敏感性較高。張麗等[12]報(bào)道所檢CRKP敏感性最高的抗菌藥物為替加環(huán)素（83.3%）；UZ ZAMAN等[13]報(bào)道所檢CRKP敏感性最高的抗菌藥物為阿米卡星（8.7%）；BONURA等[14]報(bào)道對(duì)CRKP敏感性較高的抗菌藥物為多黏菌素（42.6%）、阿米卡星（40.4%）和慶大霉素（40.4%）。本研究受試CRKP對(duì)試驗(yàn)中應(yīng)用的碳青霉烯類、青霉素類、喹諾酮類和頭孢類抗菌藥物均不敏感，僅部分 CRKP對(duì)替加環(huán)素（100%）、磷霉素（24.0%）和阿米卡星（1.9%）具有敏感性。本研究受試CRKP對(duì)替加環(huán)素敏感率最高，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道相一致。對(duì)阿米卡星敏感率較低，與國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道存在一定差異，可能與上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院臨床藥物使用方法和習(xí)慣不同有關(guān)。值得注意的是，本研究有67.3%的受試CRKP對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑敏感，與目前國(guó)內(nèi)外研究相比敏感性較高，這對(duì)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院臨床治療有指導(dǎo)意義。因此，建議上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院臨床治療CRKP感染患者首選替加環(huán)素或復(fù)方磺胺甲噁唑，同時(shí)應(yīng)注意減少治療時(shí)碳青霉烯類等各類抗菌藥物的濫用，防止CRKP耐藥形勢(shì)的進(jìn)一步惡化。

自1996年首次發(fā)現(xiàn)blaKPC酶以來(lái)，各國(guó)均有產(chǎn)blaKPC酶型CRKP流行的報(bào)道[15]，我國(guó)多地也報(bào)道了產(chǎn)blaKPC-2酶型CRKP的高檢出率，產(chǎn)blaKPC-2酶已成為我國(guó)肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥的重要原因[16]。本研究分離的CRKP均檢出blaKPC-2基因，其余基因陽(yáng)性率極低甚至無(wú)陽(yáng)性，表明blaKPC-2酶是上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院CRKP感染患者對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要原因。醫(yī)務(wù)人員應(yīng)對(duì)CRKP的傳播與感染提高警惕，盡早采取措施檢測(cè)患者感染菌的耐藥情況，根據(jù)CRKP常見(jiàn)類型與特性選取合適的治療手段。

在多種肺炎克雷伯菌的流行病學(xué)分型方法中，PFGE是一種有效、應(yīng)用廣泛的技術(shù)，采用PFGE進(jìn)行分型可以研究菌株之間的遺傳差異，并為監(jiān)測(cè)傳染病的暴發(fā)流行、追蹤傳染源提供依據(jù)。

本研究采用PFGE將107株CRKP分為A型～X型，其中在A型21株CRKP中有15株（71.4%）分離于1個(gè)月內(nèi)（2015年5月29日—6月29日），在F型6株CRKP中有4株分離于2周內(nèi)（2015年4月2—15日）。醫(yī)院感染暴發(fā)定義為在醫(yī)療機(jī)構(gòu)或其科室的患者中，短時(shí)間內(nèi)發(fā)生3例以上同種同源感染病例[17]。因此根據(jù)本研究數(shù)據(jù)得出結(jié)論，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院于2015年5月29日—6月29日與2015年4月2—15日期間分別發(fā)生CRKP感染暴發(fā)，A型與F型菌株是導(dǎo)致上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院在這2個(gè)時(shí)期內(nèi)出現(xiàn)CRKP感染暴發(fā)的重要原因。其余22型菌株散發(fā)于不同時(shí)期和不同病區(qū)，判斷為散發(fā)菌株。

JIAO等[18]提出CRKP感染暴發(fā)與使用碳青霉烯類、糖肽類、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、第3代頭孢菌素抗菌藥物，有氣管切開(kāi)史和年齡增長(zhǎng)等危險(xiǎn)因素有關(guān)。因此臨床應(yīng)格外重視抗菌藥物（尤其是碳青霉烯類、第3代頭孢菌素等抗菌藥物）的合理使用，重視接受侵襲性操作患者的感染防治，重視老年患者的有效護(hù)理與合理治療方案的制定。此外，神經(jīng)外科、外科ICU等高危病區(qū)患者自身情況較差，所患疾病較嚴(yán)重，多數(shù)患者有既往手術(shù)史，更易發(fā)生感染并遷延不愈，且長(zhǎng)期使用各類抗菌藥物，易致病菌耐藥性增強(qiáng)，臨床應(yīng)加強(qiáng)對(duì)此類患者的護(hù)理，減少其與感染源接觸的機(jī)會(huì)，切斷感染途徑。

目前，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院2013年1月—2015年8月CRKP的傳播來(lái)源與傳播途徑尚未明確。有研究指出醫(yī)務(wù)人員雙手、醫(yī)療器械和環(huán)境表面可直接傳播耐藥菌株[19]，是病菌院內(nèi)傳播的主要原因。

肺炎克雷伯菌是一種重要的醫(yī)院感染致病菌，CRKP的出現(xiàn)增加了上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院臨床對(duì)肺炎克雷伯菌感染患者治療的難度，而院內(nèi)人員大量流動(dòng)以及科室間使用抗菌藥物習(xí)慣不同等多方面因素也將導(dǎo)致醫(yī)院CRKP型別的不斷演變，甚至出現(xiàn)新型別的流行傳播。因此，醫(yī)護(hù)人員應(yīng)合理使用抗菌藥物，規(guī)范醫(yī)療操作步驟，控制肺炎克雷伯菌的耐藥狀態(tài)，同時(shí)注意病區(qū)內(nèi)與病區(qū)間預(yù)防措施的實(shí)施，避免此類病菌的院內(nèi)傳播和不斷演變。

[1]TSAKRIS A， KRISTO I， POULOU A， et al.First occurrence of KPC-2-possessing Klebsiella pneumoniae in a Greek hospital and recommendation for detection with boronic acid disc tests[J]. J Antimicrob Chemother， 2008， 62（6）： 1257-1260.

[2]胡付品， 朱德妹， 汪復(fù)， 等. 2014年CHINET中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J]. 中國(guó)感染與化療雜志，2015，15（5）： 401-410.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S]. M100-S25， CLSI， 2015.

[4]王輝， 俞云松， 王明貴， 等. 替加環(huán)素體外藥敏試驗(yàn)操作規(guī)程專家共識(shí)[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013， 36（7）： 584-587.

[5]SHIBATA N， DOI Y， YAMANE K， et al. PCR typing of genetic determinants for metallo-betalactamases and integrases carried by gram-negative bacteria isolated in Japan， with focus on the class 3 integron[J]. J Clin Microbiol， 2003， 41（12）：5407-5413.

[6]KRüTTGEN A， RAZAVI S， IM?HL M，et al.Real-time PCR assay and a synthetic positive control for the rapid and sensitive detection of the emerging resistance gene New Delhi metallo-β-lactamase-1（bla（NDM-1））[J]. Med Microbiol Immunol，2011， 200（2）： 137-141.

[7]SMITH MOLAND E， HANSON N D， HERRERA V L， et al. Plasmid-mediated， carbapenemhydrolysing beta-lactamase， KPC-2， in Klebsiella pneumoniae isolates[J]. J Antimicrob Chemother，2003， 51（3）： 711-714.

[8]TALON D， CAILLEAUX V， THOUVEREZ M，et al. Discriminatory power and usefulness of pulsedfield gel electrophoresis in epidemiological studies of Pseudomonas aeruginosa[J]. J Hosp Infect， 1996，32（2）： 135-145.

[9]AGODI A， BARCHITTA M， QUATTROCCHI A， et al. Antibiotic trends of Klebsiella pneumoniae and Acinetobacter baumannii resistance indicators in an intensive care unit of Southern Italy， 2008-2013[J].Antimicrob Resist Infect Control， 2015， 4： 43.

[10]SHAIKH S， FATIMA J， SHAKIL S， et al.Antibiotic resistance and extended spectrum betalactamases： types， epidemiology and treatment[J].Saudi J Biol Sci， 2015， 22（1）： 90-101.

[11]NEUNER E A， YEH J Y， HALL G S， et al.Treatment and outcomes in carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae bloodstream infections[J].Diagn Microbiol Infect Dis， 2011， 69（4）： 357-362.

[12]張麗， 朱元祺， 張小兵， 等. 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的耐藥基因檢測(cè)[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志， 2014，24（23）： 5734-5736.

[13]UZ ZAMAN T， ALDREES M， AL JOHANI S M， et al. Multi-drug carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae infection carrying the OXA-48 gene and showing variations in outer membrane protein 36 causing an outbreak in a tertiary care hospital in Riyadh， Saudi Arabia[J]. Int J Infect Dis， 2014，28： 186-192.

[14]BONURA C， GIUFFRè M， ALEO A， et al. An update of the evolving epidemic of blaKPC carrying Klebsiella pneumoniae in Sicily， Italy， 2014：emergence of multiple non-ST258 clones[J]. PLoS One， 2015， 10（7）： e0132936.

[15]MUNOZ-PRICE L S， POIREL L， BONOMO R A， et al. Clinical epidemiology of the global expansion of Klebsiella pneumoniae carbapenemases[J]. Lancet Infect Dis， 2013， 13（9）： 785-796.

[16]CHENG L， CAO X L， ZHANG Z F， et al.Clonal dissemination of KPC-2 producing Klebsiella pneumoniae ST11 clone with high prevalence of oqxAB and rmtB in a tertiary hospital in China：results from a 3-year period[J]. Ann Clin Microbiol Antimicrob， 2016， 15： 1.

[17]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. 醫(yī)院感染管理辦法[J]. 中國(guó)護(hù)理管理， 2006，6（7）： 5-7.

[18]JIAO Y， QIN Y， LIU J， et al. Risk factors for carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae infection/colonization and predictors of mortality： a retrospective study[J]. Pathog Glob Health， 2015，109（2）： 68-74.

[19]BEARMAN G M， ROSATO A， ELAM K，et al.A crossover trial of antimicrobial scrubs to reduce methicillin-resistant Staphylococcus aureus burden on healthcare worker apparel[J]. Infect Control Hosp Epidemiol， 2012， 33（3）： 268-275.