袁園 張瀟 張凱 楊剛

摘要：以酸性乙醇為提取劑，采用微波輔助法提取黑豆皮中的青花素，先研究了提取液的pH值、乙醇濃度、溫度、料液比、時(shí)間等單因素實(shí)驗(yàn)的影響，再在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)，篩選出了在各因素共同作用下的最佳提取工藝。最佳工藝條件為：乙醇濃度70%，料液比1：40，提取溫度為70℃，時(shí)間為8min。測(cè)得花青素含量為4. 887 mg/g黑豆皮。該提取工藝穩(wěn)定可行，可為黑豆花青素的提取提供參考。

關(guān)鍵詞：黑豆;花青素;微波提取;正交實(shí)驗(yàn)

中圖分類號(hào)：TS202.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-9944（2018）2-0171-03

1 引言

黑豆（ Black Soybean），豆科植物，又稱黑大豆、烏豆等，原產(chǎn)于中國。黑豆富含蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、維生素等多種營養(yǎng)成分，并且有活血、利水、祛風(fēng)、清熱解毒、滋養(yǎng)健血、補(bǔ)虛烏發(fā)的功能。花青素是黑豆皮色素的主要成分之一，是一種非常好的抗氧化劑，具有多種生理活性功能。黑豆皮花青素作為一種天然色素，在酸性條件下穩(wěn)定，天然無毒，是一種安全的、健康的食品添加劑[1，2]。

微波輔助技術(shù)具有設(shè)備簡(jiǎn)單、提取效果好、時(shí)間短、效率高的優(yōu)點(diǎn)，微波輻射容易破壞細(xì)胞，從而使有效成分在短時(shí)間內(nèi)從細(xì)胞內(nèi)溶出。目前，微波輔助法已經(jīng)是提取植物中有效成分的熱點(diǎn)，已運(yùn)用于提取多種植物的有效成分，但利用微波輔助法對(duì)黑豆中花青素的提取工藝的研究卻鮮有報(bào)道。因而本實(shí)驗(yàn)利用微波輔助法提取黑豆中的花青素，以原花青素含量為指標(biāo)，在pH值、乙醇濃度、溫度、料液比、時(shí)間5個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交實(shí)驗(yàn)確定黑豆中花青素的最佳提取條件。

我國黑豆資源豐富，以黑豆為原料，開發(fā)利用花青素及相關(guān)產(chǎn)品具有便利的條件，以期為黑豆中花青素的工業(yè)化提取提供參考，也為進(jìn)一步研究花青素的生物學(xué)活性及在保健食品和食品添加劑的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)[3，4]。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

黑豆皮，安國市御顏坊中藥材有限公司;原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，上海金穗生物科技有限公司，乙醇，鹽酸，甲醇，香草醛，均為分析純。

2.2 儀器與設(shè)備

Cary 60紫外分光光度計(jì)，美國安捷倫儀器有限公司產(chǎn)品;AL104電子天平，梅特勒托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品;PHSJ-3F型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;SHZⅢ型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠;MAS-3微波萃取器，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司。

2.3 溶液的配制

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

精密稱取0. 1000 g的原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水配制成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品水溶液。

2.3.2 顯色劑的配制

（1）香草醛 甲醇溶液。準(zhǔn)確稱取1.000 g香草醛，用甲醇定容至100 mL，配制成濃度為1%（ W/V）的香草醛甲醇溶液。

（2）鹽酸甲醇溶液。用移液管量取15. 00 mL濃鹽酸，用甲醇稀釋定容至100 mL，配制成15%（V/V）的鹽酸 甲醇溶液。

（3）顯色劑。1%（ W/V）的香草醛甲醇溶液：15%（ V/V）的鹽酸甲醇溶液=1：1。

2.4 方法

2.4.1 黑豆皮中花青素的提取工藝

黑豆皮干燥到恒重，粉碎一過60目篩一準(zhǔn)確稱取1g一加入一定酸度的乙醇溶液一微波提取2次一抽濾一合并提取液一加入提取液定容至50 mL- 530 nm[5，6]處測(cè)吸光度。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精確吸取2、4、6、8、10 mL已配置好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液至100 mL容量瓶中，加入一定量的顯色劑，并用1%的鹽酸甲醇溶液稀釋至刻度，在530 nm下，以蒸餾水作為參比，測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以香草醛的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，并作回歸處理，得回歸方程y =O.0711X+O. 0051，r=0.9991。

2.4.3 黑豆皮中花青素的測(cè)定

用移液管精準(zhǔn)吸取1 mL提取液，置于25 mL容量瓶中，用相應(yīng)浸提液稀釋至刻度，以蒸餾水作參比在波長(zhǎng)530 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出花青素提取液的濃度，按照以下公式計(jì)算黑豆皮中的花青素的質(zhì)量。

黑豆皮中的花青素的質(zhì)量m=cVK

其中，c為測(cè)量液中花青素的濃度（μg/mL）;V為提取液體積（mL）;K為提取液稀釋的倍數(shù)。

2.4.4 單因素實(shí)驗(yàn)

以預(yù)處理過的黑豆皮粉為原料，利用微波提取法，以香草醛含量為指標(biāo)，經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)初步考察提取液的pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比、提取時(shí)間5個(gè)因素對(duì)黑豆皮中花青素的質(zhì)量的影響。

用2 mol/L的HC1調(diào)節(jié)50%的乙醇溶液的pH值分別為0.5、1.O、1.5、2.O、2.5、3.O，料液比1：25 （g/mL），設(shè)置儀器參數(shù)為60℃，10 min，300 r/min，研究提取液的pH值對(duì)花青素含量的影響。

分別以pH =1的體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇為提取劑，料液比1：25（ g/mL），設(shè)置儀器參數(shù)60℃，10 min，300 r/min，研究乙醇濃度對(duì)花青素含量的影響。

以pH=l的70%乙醇溶液作提取劑，料液比1：25（ g/mL），時(shí)間分別為5、6、7、8、9、10 min，60℃，300r/min，研究提取時(shí)間對(duì)花青素含量的影響。

以pH=l的70%乙醇溶液作提取劑，料液比1：25（ g/mL），300 r/min，8 min，分別設(shè)置溫度至40、50、60、70、80c，研究提取溫度對(duì)花青素含量的影響。

以pH=l的70%乙醇溶液作提取劑，以料液比1：30、1： 40、1： 50、1： 60、1：70（ g/mL），微波處理8min，60℃，300 r/min，研究料液比對(duì)花青素含量的影響。

2.4.5 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取微波提取溫度、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比為實(shí)驗(yàn)因素，采用正交表L9（34）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以波長(zhǎng)530 nm處的吸光度為考察指標(biāo)，確定黑豆皮青花素的最佳提取條件。

3 結(jié)果與分析

3.1 浸提液pH值對(duì)花青素提取效果的影響

花青素在酸性條件下較為穩(wěn)定，因此浸提液pH值對(duì)青花素的提取影響較大，在實(shí)驗(yàn)中提取液顏色為酒紅色，測(cè)得其吸光度情況見圖1所示。

從圖1中可以看出，色素的吸光度隨pH值的增大，呈現(xiàn)先增大后建校的趨勢(shì)，可能是色素結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的緣故。由圖可知，在pH=l時(shí)，吸光度最大，提取效果最好，因而確定浸提液的pH值為1.O。

3.2 乙醇濃度對(duì)花青素提取效果的影響

花青素易溶于水、甲醇、乙醇、稀酸、稀堿中，考慮了溶劑的特性，出于綠色化學(xué)的角度，選用了乙醇的水溶液作為提取劑，不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)花青素提取效果的影響如圖2。

從圖2中可以看出，在乙醇濃度為70%是的提取效果最好，濃度繼續(xù)上升時(shí)，吸光度反而減小，這是由于乙醇濃度太大，溶液的極性減小，黑豆皮中花青素的溶解度降低，且更多的醇溶性雜質(zhì)被溶出。因而在此次實(shí)驗(yàn)中，確定提取液的乙醇濃度為70%。

3.3 提取時(shí)間對(duì)花青素提取效果的影響

由圖3可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，青花素的濃度也隨之增加，到8 min時(shí)達(dá)到頂點(diǎn)，然后下降。分子在微波場(chǎng)的作用下能產(chǎn)生瞬時(shí)極化并迅速生成大量的熱能，促使細(xì)胞破裂，使細(xì)胞液溢出并擴(kuò)散至溶劑中。時(shí)間過長(zhǎng)，可能會(huì)破壞提取液中的有效成分。在此次實(shí)驗(yàn)中，提取時(shí)間確定為8 min。

3.4 提取溫度對(duì)青花素提取效果的影響

由圖4可知，花青素濃度隨著溫度的增加而增加，在60℃時(shí)最高，提取效果最好，再升高溫度，溫度隨之下降，這是由于隨著溫度升高，熱運(yùn)動(dòng)加速，花青素更易流出。但是在過高溫度的條件下，花青素的結(jié)構(gòu)遭到破壞，降低提取效果，因此在提取過程中要避免溫度過高。

3.5 料液比對(duì)花青素提取效果的影響

由圖5可知，在料液比為1：40時(shí)提取效果最好，1：30時(shí)由于料液比太小，有效成分還未完全溶出就已達(dá)到飽和，而再增加料液比時(shí)，由于有效成分已完全溶出，溶劑增加，濃度變小。在此次實(shí)驗(yàn)中，選取料液比為1： 40。

3.6 正交實(shí)驗(yàn)

在考察了浸提液pH值、乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、轉(zhuǎn)速、料液比對(duì)黑豆皮青花素提取效果的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)乙醇濃度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）、提取溫度（D）等因素進(jìn)行4因素3水平L9 （34）正交實(shí)驗(yàn)，以優(yōu)化其提取工藝（表1～3）。

從表2和表3可以看出乙醇濃度對(duì)黑豆皮花青素的提取效果有顯著的影響，其最佳提取工藝為A2 82 C2 D3，乙醇濃度為70%，8 min，料液比為1：40，提取溫度為70℃。影響提取黑豆皮青花素的各因素主次順序?yàn)锳>C>D>B，即乙醇濃度>料液比>溫度>時(shí)間，乙醇濃度的影響最為顯著（P<0.05）。

3.7 花青素含量測(cè)定

精確稱取黑豆皮粉末lg，在最佳工藝條件下微波提取2次，抽濾后定容至100 mL，準(zhǔn)確吸取2 mL提取液于25 mL容量瓶中，用浸提液稀釋到刻度，以蒸餾水作為參比，于530 nm處測(cè)定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得青花素的含量。重復(fù)此實(shí)驗(yàn)3次（表4）。

4 結(jié)論

以原花青素為指標(biāo)，利用紫外分光光度法測(cè)定黑豆中花青素的含量，通過單因素及L9 （34）正交實(shí)驗(yàn)，分析料液比、乙醇濃度、溫度、微波處理時(shí)間對(duì)黑豆皮中花青素含量影響，并優(yōu)化最佳提取條件，經(jīng)分析可知微波提取黑豆青花素的最佳工藝為乙醇濃度70%，料液比1：40，溫度為70℃，提取時(shí)間8 min。經(jīng)計(jì)算，花青素的含量為4. 887 mg/g黑豆皮。微波輔助提取黑豆中花青素體現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢(shì)，溫度低、時(shí)間短、效率高，可為黑豆中花青素的開發(fā)應(yīng)用以及工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

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