姜業(yè)朝， 龔愛琴， 張宇航

(揚(yáng)州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225127)

*聯(lián)系人：龔愛琴，女，1974年出生，博士研究生，副教授。研究方向：儀器分析、藥物分析。

提出了一種高效液相色譜法測定安奈格列汀含量的新方法。采用VP-ODS(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱，以10.0 mmol/L磷酸二氫鉀-乙腈緩沖液(pH=5.5)(60∶40)為流動(dòng)相，流速為0.80 mL/min，檢測波長為248 nm。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，安奈格列汀的質(zhì)量濃度為2.0 μg/mL～50.0 μg/mL時(shí)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性方程為A=103.91c+23.45，r=0.999 8，平均回收率為99.71%，RSD為0.50%(n=9)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法結(jié)果準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，適用于安奈格列汀的質(zhì)量控制及含量檢測。

安奈格列??；降糖藥；HPLC；測定

新型降糖藥安奈格列汀(anagliptin)結(jié)構(gòu)式如圖1所示，2012年在日本首次上市，屬于二肽基肽酶-4抑制劑(DPP-4)，對DPP-4酶具有強(qiáng)效、高選擇性抑制作用，目前中國尚在臨床階段。在日本進(jìn)行的一項(xiàng)臨床研究表明，安奈格列汀具有顯著改善血糖水平的效果，與阿卡波糖等聯(lián)合使用能更有效地改善血糖控制，并且不會使患者體重增加或發(fā)生低血糖現(xiàn)象[1，2]，因此，該藥具有良好的應(yīng)用前景。但文獻(xiàn)調(diào)研顯示，該藥含量的測定方法國內(nèi)外報(bào)道很少。目前，藥物含量測定方法應(yīng)用較多的是HPLC[3-6]。本研究擬采用HPLC法測定安奈格列汀含量，旨在為藥物的質(zhì)量控制提供方便有效的檢測方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

大連伊利特高效液相色譜儀，帶紫外檢測器和N2000數(shù)據(jù)處理工作站；上海美普達(dá)1801紫外-可見分光光度計(jì)；上海精科雷磁pH S-25酸度計(jì)。

圖1 安奈格列汀結(jié)構(gòu)式

安奈格列汀標(biāo)準(zhǔn)品和藥片(批號20160801、20160802、20160803，規(guī)格100 mg/片)；乙腈(色譜純)、磷酸二氫鉀(分析純)，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 溶液配制

1.2.1 流動(dòng)相

10 mmol/L磷酸二氫鉀(取磷酸二氫鉀0.68 g，加水溶解并稀釋至500 mL，用氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至5.5)-乙腈緩沖液，體積比為60∶40，用0.45 μm微孔濾膜過濾脫氣后使用。

1.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取安奈格列汀對照品適量，加水溶解并定量稀釋，制成每1 mL中含安奈格列汀0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備

取安奈格列汀藥片5片，研磨均勻。取樣品粉末適量，加水溶解并定量稀釋，制成每1 mL中約含安奈格列汀0.1 mg的溶液，過濾。取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.2.4 陰性對照溶液的制備

根據(jù)安奈格列汀片制劑配方，配制不含安奈格列汀的陰性對照粉末。精密稱取陰性對照粉末適量，按照“供試品溶液的制備”方法制備陰性對照溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱：Shimadzu VP-ODS(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱溫：20 ℃；檢測波長248 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

取各項(xiàng)目下溶液，進(jìn)樣20 μL，注入液相色譜儀，在色譜條件下測定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算其含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 測定波長的選擇

實(shí)驗(yàn)中掃描了安奈格列汀的吸收光譜曲線，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，安奈格列汀在248 nm處有最大吸收。因此，選擇248 nm作為HPLC中的檢測波長。

圖2 安奈格列汀吸收曲線

2.2 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)中分別嘗試了甲醇、乙腈、甲醇-水、乙腈-水，但發(fā)現(xiàn)出峰效果均不理想。改為磷酸二氫鉀-乙腈溶液為流動(dòng)相后，出峰效果慢慢改善，并且峰形隨兩者配比的變化而不同。當(dāng)磷酸二氫鉀-乙腈溶液體積比為60∶40時(shí)，峰形對稱且峰較窄(見圖3)。實(shí)驗(yàn)中選用磷酸二氫鉀(10 mmol/L磷酸二氫鉀溶液，用氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH至5.5)-乙腈溶液=60∶40為流動(dòng)相。

2.3 工作曲線與檢出限

取對照品適量，分別配成2.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.3色譜條件下，分別精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積(A)與濃度(c)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，安奈格列汀質(zhì)量濃度在2.0 μg/mL～50.0 μg/mL線性關(guān)系良好，回歸方程為A=103.91c+23.45，r=0.999 8。

圖3 磷酸二氫鉀-乙腈(60∶40)為流動(dòng)相時(shí)色譜圖

取5.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋，測定方法的檢出限與定量限。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檢出限(S/N≥3)為0.1 μg/mL，定量限(S/N≥10)為0.3 μg/mL。

2.4 方法的精密度、再現(xiàn)性與穩(wěn)定性

取線性關(guān)系中的20.0 μg/mL溶液連續(xù)進(jìn)樣6針，以峰面積評價(jià)方法的精密度。結(jié)果表明，6個(gè)峰面積的RSD為0.33%，表明方法具有較好的重現(xiàn)性。

由3個(gè)不同人員分別取同一份供試品，按照色譜操作條件測定安奈格列汀含量，每人平行測定2次，用外標(biāo)法計(jì)算含量，測得數(shù)據(jù)分別為100.2%、99.81%、99.21%、99.48%、99.70%、100.5%，RSD為0.21%，表明方法的再現(xiàn)性較好。

取批號為20160801供試品溶液，在10 h內(nèi)每隔2 h分別測定一次峰面積。結(jié)果顯示，峰面積的RSD為0.26%，表明樣品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

取陰性對照品溶液，加入適量對照品，分別制成質(zhì)量濃度為10.0、20.0、30.0 μg/mL的樣品溶液，每種溶液平行配制3份，測定其峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，回收率分別為99.20%、99.51%、99.43%、99.77%、100.5%、99.40%、99.69%、99.51%、100.61%。平均回收率為99.71%，RSD為0.50%，表明方法的回收率較好，共存組分干擾小。2.6 樣品測定

用本方法對3批樣品進(jìn)行了測定，結(jié)果含量分別為標(biāo)示量的99.5%(20160801)、100.5%(20160802)、99.3%(20160803)。

3 結(jié)論

提出了一種高效液相色譜法測定新型降糖藥安奈格列汀含量的新方法，對流動(dòng)相的種類進(jìn)行了優(yōu)化。精密度、穩(wěn)定性、回收率實(shí)驗(yàn)均表明，方法的準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，可以用于實(shí)際樣品分析，從而拓展了安奈格列汀含量測定方法。

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