黃達(dá)明,杜卓蓉,張志才,管國(guó)強(qiáng)

(江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

坎利酮(canrenone)是一種甾體激素類心血管藥物,臨床上可用作醛固酮拮抗劑治療水腫、心衰、高血壓、肝腹水等疾病?？怖委熜难芗膊〉男Ч^為顯著,但若用于治療心臟病,可能存在用藥過(guò)量而導(dǎo)致死亡的危險(xiǎn)后果,且其對(duì)強(qiáng)心劑地高辛(digoxin)的定量檢測(cè)有負(fù)面干擾[1]。因此人們開始通過(guò)生物或化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法對(duì)坎利酮進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,以期增強(qiáng)藥效并減少副作用。在坎利酮的眾多羥基化衍生物中,11α-羥基坎利酮受到廣泛關(guān)注。因?yàn)樗呛铣闪硪环N心血管藥物依普利酮的重要醫(yī)藥中間體。依普利酮與坎利酮相比,副作用明顯減小[2]。因此,11α-羥基坎利酮具有極大的市場(chǎng)需求。

微生物可以通過(guò)其胞內(nèi)的11α-羥化酶對(duì)甾體底物進(jìn)行羥基化。國(guó)內(nèi)外目前對(duì)甾體類化合物的微生物轉(zhuǎn)化研究都集中在液態(tài)發(fā)酵的領(lǐng)域。由于甾體化合物水不溶性的特性,在液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中往往要添加各類表面活性劑作為底物助溶劑,增加底物在發(fā)酵液中的溶解度,從而提高轉(zhuǎn)化率[3-6]。如王森[4]利用黑根霉轉(zhuǎn)化16α,17α-環(huán)氧黃體酮,并添加吐溫為底物助溶劑,最終轉(zhuǎn)化率達(dá)到45%,KOLET S P等[5]利用毛霉轉(zhuǎn)化黃體酮,并添加四氫呋喃為底物助溶劑,最終轉(zhuǎn)化率達(dá)到94%,RESTAINO O F等[6]利用玫瑰產(chǎn)色鏈霉菌轉(zhuǎn)化氫化可的松,并添加二甲基甲酰胺(dimethylformamide,DMF)為底物助溶劑,最終轉(zhuǎn)化率達(dá)到(58±2.9)%；在底物為坎利酮的甾體化合物微生物液態(tài)發(fā)酵研究中,劉曉等[7]通過(guò)赭曲霉的高密度培養(yǎng),在7 L發(fā)酵罐進(jìn)行工藝放大,坎利酮轉(zhuǎn)化率為86.1%；黃達(dá)明等[8]通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)化工藝條件,最終使坎利酮的轉(zhuǎn)化率達(dá)到87.68%；張曉麗等[9]則研究了單一乳化劑sp60、sp80、tw60、tw80和復(fù)合乳化劑對(duì)坎利酮增溶及轉(zhuǎn)化率的影響,最終通過(guò)添加復(fù)合乳化劑,使轉(zhuǎn)化率達(dá)到92.22%；CONTENTE M L等[10]通過(guò)赭曲霉富氧培養(yǎng),并添加二甲基亞砜為坎利酮的助溶劑,使轉(zhuǎn)化率＞95%。

這些研究為坎利酮羥基化提供了理論依據(jù),但液態(tài)發(fā)酵存在局限性:由于甾體類化合物不溶于水的特性會(huì)大大降低其在液態(tài)發(fā)酵液中的轉(zhuǎn)化率,所以大部分研究都選擇在液態(tài)發(fā)酵液中添加表面活性劑促進(jìn)底物的溶解。但表面活性劑的添加對(duì)菌體的生長(zhǎng)有一些影響,且實(shí)踐證明,添加了表面活性劑之后的甾體底物并不能完全溶于發(fā)酵液[11],而是以小顆粒的形態(tài)存在,這樣就會(huì)降低坎利酮的轉(zhuǎn)化率。固態(tài)發(fā)酵則可以解決以上問(wèn)題,同時(shí),固態(tài)發(fā)酵提取產(chǎn)物時(shí)對(duì)于提取劑沒(méi)有特殊要求,只需選擇有機(jī)溶劑如無(wú)毒的乙醇即可,而液態(tài)發(fā)酵需要選擇可以溶解11α-坎利酮卻不與發(fā)酵液互溶的乙酸乙酯進(jìn)行萃取,乙酸乙酯是低毒溶劑,會(huì)對(duì)人體和環(huán)境產(chǎn)生不良影響[12-13]。

本研究擬利用根霉(Rhizopussp.)UJS-0602對(duì)坎利酮進(jìn)行特異性轉(zhuǎn)化生成11α-羥基坎利酮,并優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵轉(zhuǎn)化坎利酮的培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)條件。以期證明新型固態(tài)發(fā)酵轉(zhuǎn)化坎利酮生成11α-羥基坎利酮的可能性,為后續(xù)的化學(xué)合成依普利酮提供必要的中間體。彌補(bǔ)了液態(tài)發(fā)酵轉(zhuǎn)化方法中存在的不足:解決液態(tài)發(fā)酵轉(zhuǎn)化過(guò)程中坎利酮甾體底物水不溶性的問(wèn)題,提高轉(zhuǎn)化率,并使得產(chǎn)物提取過(guò)程綠色安全。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種為根霉(Rhizopussp.)UJS-0602:保藏于本實(shí)驗(yàn)室菌物柜。

發(fā)酵基質(zhì)大米:市售；坎利酮(分析純):浙江朗華制藥有限公司；甲醇(色譜級(jí)):美國(guó)TEDIA公司；其他試劑均為市售分析純。

保藏斜面為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基:取土豆200 g蒸煮后過(guò)濾得到浸出液,加入葡萄糖20 g并加水定容至1 000 mL。固態(tài)發(fā)酵轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基組成為大米基質(zhì)20g,自來(lái)水20mL,底物添加量為10%(按發(fā)酵基質(zhì)質(zhì)量計(jì))。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀:日本Shimadzu公司；ZC-2102GZ光照恒溫?fù)u床:常州中誠(chéng)儀器制造有限公司；BCD-206TS冰箱:青島海爾股份有限公司；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺(tái):蘇州凈化設(shè)備有限公司；FA1004精密天平:上海天平儀器有限公司；XSP-BM-2CA生物顯微鏡:上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司；YX280A手提式不銹鋼蒸汽滅菌器:上海三申醫(yī)療器械有限公司；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)及底物轉(zhuǎn)化方法

斜面菌種制備:將根霉(Rhizopussp.)UJS-0602置于PDA培養(yǎng)基上,28℃環(huán)境下培養(yǎng)3～4 d,待培養(yǎng)斜面底部變成紅色,表面長(zhǎng)滿金黃色孢子時(shí),即得到生產(chǎn)斜面,于4℃冰箱冷藏保存,保藏時(shí)間在7 d以內(nèi)。

孢子懸液制備:在無(wú)菌環(huán)境下,將無(wú)菌水加入生產(chǎn)斜面沖下孢子,加入無(wú)菌水計(jì)數(shù)調(diào)節(jié)孢子懸液濃度為108個(gè)/mL。

一級(jí)種子液培養(yǎng):孢子懸浮液(108個(gè)/mL)以5%的接種量接入滅菌后的一級(jí)種子培養(yǎng)基中,在溫度為28℃,轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床中培養(yǎng)48 h后得到一級(jí)種子液。

固態(tài)發(fā)酵轉(zhuǎn)化:將所得的一級(jí)種子液接入滅菌后的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中,接種量為0.1 mL/g發(fā)酵基質(zhì),在培養(yǎng)基pH=7,培養(yǎng)溫度為27℃的條件下發(fā)酵72～96 h后結(jié)束轉(zhuǎn)化。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

考察碳源種類(葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、木糖、糊精、甘油)、碳源添加量(0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%)、氮源種類(蛋白胨、玉米蛋白粉、豆粕、酵母膏、牛肉膏、(NH4)2SO4、KNO3)、氮源添加量(0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%)、無(wú)機(jī)鹽種類(FeSO4、CuSO4、MnSO4、MgSO4)、營(yíng)養(yǎng)因子種類(甘氨酸、VB2、VB6、VB12、3,5-二硝基水楊酸)、營(yíng)養(yǎng)因子添加量(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)、料水比(1.0∶2、1.5∶2、1.0∶1、2.5∶2、3.0∶2(g∶mL))、底物添加量(10%、15%、20%、25%、30%)對(duì)底物轉(zhuǎn)化率的影響。

1.3.3 正交試驗(yàn)

利用單因素試驗(yàn)篩選出的初始條件設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),即以轉(zhuǎn)化率為考察指標(biāo),選取碳源添加量(A)、氮源添加量(B)、營(yíng)養(yǎng)因子(C)、料水比(D)、底物添加量(E)為正交試驗(yàn)的5個(gè)因素,采用L16(45)正交試驗(yàn)優(yōu)化轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基組成,正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for medium formula optimization

1.3.4 提取及檢測(cè)方法

取轉(zhuǎn)化后的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基2 g,加入50 mL無(wú)水乙醇,于150 r/min搖床中振蕩提取2 h后減壓抽濾得到濾液,再使用無(wú)水乙醇反復(fù)沖洗濾渣3次后合并濾液,于60℃條件下減壓蒸干,加入無(wú)水乙醇復(fù)溶后定容至50mL。用0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾,供分析測(cè)定使用。

液相色譜柱為AgilentZORBAXEclipseXDB-C18(150mm×4.6 mm,5 μm)；測(cè)定條件根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[14]作適當(dāng)調(diào)整:以甲醇和水為流動(dòng)相,利用甲醇溶液連續(xù)梯度洗脫,體積分?jǐn)?shù)從60%升至80%,洗脫時(shí)間13.53 min；流速0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫:30℃；進(jìn)樣量5 μL。

取80℃烘干的11α-羥基坎利酮標(biāo)品0.500 0 g,定容至100 mL,配制出5.0 g/L的母液,然后稀釋配制成0.5 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L、3.0 g/L、4.0 g/L、5.0 g/L不同濃度梯度的稀釋液進(jìn)行HPLC分析,繪制11α-羥基坎利酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到11α-羥基坎利酮質(zhì)量濃度(Y)與吸收峰面積(X)的線性回歸方程為Y=6935788.56X+10587476.56,根據(jù)產(chǎn)物峰面積計(jì)算產(chǎn)物含量從而得到產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率,其計(jì)算公式為:

式中:m0為產(chǎn)物測(cè)定質(zhì)量,g；m為底物投入質(zhì)量,g。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源種類及水平的確定

碳源是C11α-羥基化過(guò)程中重要的營(yíng)養(yǎng)和能源物質(zhì),為菌體提供生長(zhǎng)所需的碳架和轉(zhuǎn)化底物所需的代謝能,并為羥基化反應(yīng)提供還原力,對(duì)甾體轉(zhuǎn)化過(guò)程影響較大。本實(shí)驗(yàn)分別考察不同碳源對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響,結(jié)果見圖1。

由圖1可知,與未添加碳源的對(duì)照組相比,葡萄糖與果糖作為培養(yǎng)基碳源時(shí)底物的轉(zhuǎn)化率較高,其中葡萄糖最有利于坎利酮的C11α-羥基化,轉(zhuǎn)化率可達(dá)90.39%。不同微生物對(duì)碳源的偏好性不同,不同碳源會(huì)影響代謝活動(dòng)中各種酶的表達(dá)。本研究得到的最佳碳源為葡萄糖的結(jié)論與趙玉金等[15-16]研究得到的結(jié)果一致。這可能是由于葡萄糖是可以被菌體快速利用的碳源,菌體需要利用碳源生長(zhǎng)繁殖后產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物羥化酶來(lái)催化底物的羥基化反應(yīng),且葡萄糖價(jià)廉易得,廣泛應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。因此選擇葡萄糖作為轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的最佳碳源。

在培養(yǎng)基中分別添加0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%不同比例的葡萄糖,考察葡萄糖添加量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響,結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知,當(dāng)葡萄糖添加量為1.0%時(shí),轉(zhuǎn)化率最大為90.25%。這是由于葡萄糖為速效碳源,隨著葡萄糖添加量增加,提供的能量充足,而當(dāng)葡萄糖添加量＞1.0%后,菌體代謝了過(guò)多葡萄糖,產(chǎn)生的熱量在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中難以快速揮發(fā),一定程度上影響了菌體的生長(zhǎng),繼而影響了菌體對(duì)底物的轉(zhuǎn)化。因此選擇葡萄糖添加量1.0%為宜。

2.2 氮源種類及水平的確定

氮源是構(gòu)成菌體細(xì)胞的物質(zhì),如核酸、氨基酸和蛋白質(zhì)等,并幫助細(xì)胞合成酶。涉及到酶的生物轉(zhuǎn)化需要合適足量的氮源。分別考察不同氮源對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響,結(jié)果見圖3。

圖3 不同氮源對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources on conversion ratio

由圖3可知,(NH4)2SO4為氮源時(shí),轉(zhuǎn)化率明顯高于對(duì)照組。因此選擇(NH4)2SO4為最佳氮源。在相關(guān)研究中[7,17],微生物羥基化坎利酮的最佳pH均為酸性,(NH4)2SO4可以為轉(zhuǎn)化提供弱酸性環(huán)境,便于菌體細(xì)胞利用。因此選擇(NH4)2SO4作為轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的最佳氮源。

在培養(yǎng)基中分別添加0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%不同比例的(NH4)2SO4,考察(NH4)2SO4添加量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響,結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知,硫酸銨添加量在0.4%～0.8%時(shí)轉(zhuǎn)化率不斷升高,到0.8%時(shí)達(dá)到最大,之后轉(zhuǎn)化率略有降低。這說(shuō)明當(dāng)(NH4)2SO4添加量為0.8%時(shí)可以為菌體生長(zhǎng)提供最適的弱酸性環(huán)境,轉(zhuǎn)化率最高為91.57%,當(dāng)(NH4)2SO4含量繼續(xù)升高時(shí),菌體的代謝途徑可能發(fā)生改變,產(chǎn)生用于促進(jìn)底物羥基化的羥化酶含量減少,轉(zhuǎn)化率降低。因此選擇(NH4)2SO4添加量0.8%為宜。

圖4 不同硫酸銨添加量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effects of ammonia sulfate addition on conversion ratio

2.3 無(wú)機(jī)鹽種類的確定

考察不同種類無(wú)機(jī)鹽對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果見圖5。

圖5 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effects of different inorganic salts on conversion ratio

由圖5可知,培養(yǎng)基中添加無(wú)機(jī)鹽對(duì)轉(zhuǎn)化率的提高沒(méi)有作用。微生物在生長(zhǎng)繁殖及合成產(chǎn)物的過(guò)程中需要無(wú)機(jī)鹽中微量元素作為活性物質(zhì)合成中的調(diào)節(jié)物。在產(chǎn)酶真菌酶活研究[18]中提到,無(wú)機(jī)鹽一般會(huì)在低濃度時(shí)促進(jìn)微生物生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成,高濃度時(shí)則表現(xiàn)抑制作用:當(dāng)無(wú)機(jī)鹽含量為0.5%～1.0%時(shí),菌體產(chǎn)酶量可以穩(wěn)定在較高水平,但當(dāng)含量繼續(xù)上升時(shí),產(chǎn)酶量表現(xiàn)為持續(xù)下降?？怖霓D(zhuǎn)化也是通過(guò)羥化酶的參與而完成的。本研究采用的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基是復(fù)合培養(yǎng)基,成分復(fù)雜,且此時(shí)無(wú)機(jī)鹽的額外添加量已經(jīng)達(dá)到了1.0%,已經(jīng)表現(xiàn)出對(duì)產(chǎn)物合成的抑制作用,因此轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中不需要再額外添加無(wú)機(jī)鹽。

2.4 營(yíng)養(yǎng)因子種類及水平的確定

營(yíng)養(yǎng)因子有助于菌體細(xì)胞構(gòu)成成分的合成?？疾炝瞬煌N類營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果見圖6。

圖6 不同營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 Effects of different nutritional factors on conversion ratio

由圖6可知,培養(yǎng)基中添加甘氨酸可以顯著提高轉(zhuǎn)化率。有研究表明,甘氨酸的存在可能會(huì)引起細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的改變,導(dǎo)致酶等胞內(nèi)容物更好地被動(dòng)分泌至胞外[19],從而促進(jìn)酶對(duì)底物的催化,提高轉(zhuǎn)化率。因此選擇甘氨酸作為轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的最佳營(yíng)養(yǎng)因子。

在培養(yǎng)基中分別添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的甘氨酸,考察甘氨酸添加量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響,結(jié)果如圖7所示。

圖7 不同甘氨酸添加量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.7 Effects of different glycine addition on conversion ratio

由圖7可知,甘氨酸添加量在0.8%時(shí)轉(zhuǎn)化率最高為89.02%,說(shuō)明在該添加量條件下,甘氨酸可以最大限度促進(jìn)胞內(nèi)酶的被動(dòng)運(yùn)輸,又不至于對(duì)菌體細(xì)胞壁產(chǎn)生破壞,影響菌體生長(zhǎng)代謝。因此選擇甘氨酸添加量0.8%為宜。

2.5 培養(yǎng)基水分含量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

考察基質(zhì)料水比對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果見圖8。

由圖8可知,當(dāng)發(fā)酵基質(zhì)料水比為1.0∶1(g∶mL)時(shí),轉(zhuǎn)化率最大為86.76%,明顯高于其余各組。這是由于水分是發(fā)酵過(guò)程的主要媒介,是微生物生長(zhǎng)必不可少的條件之一,水分含量太低會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)變干,微生物生長(zhǎng)困難甚至死亡,轉(zhuǎn)化率會(huì)受到很大影響；而當(dāng)含水量太高則導(dǎo)致發(fā)酵基質(zhì)透氣性下降,影響菌體生長(zhǎng)繁殖,同時(shí)發(fā)酵產(chǎn)生的熱量難以散發(fā),基質(zhì)溫度升高,增加了雜菌污染的危險(xiǎn),用于轉(zhuǎn)化的根霉生長(zhǎng)受到抑制,轉(zhuǎn)化率降低。因此當(dāng)料水比為1.0∶1(g∶mL)時(shí),對(duì)于微生物轉(zhuǎn)化是最有利的。

圖8 培養(yǎng)基水分含量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.8 Effect of moisture content of medium on conversion ratio

2.6 底物添加量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

考察不同底物添加量(10%、15%、20%、25%、30%)對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果見圖9。

圖9 底物添加量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.9 Effect of substrate addition on conversion ratio

由圖9可知,當(dāng)?shù)孜锾砑恿繛?0%時(shí),轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)82.88%。且當(dāng)?shù)孜锾砑恿恐饾u增大時(shí),轉(zhuǎn)化率不斷降低。這是由于過(guò)高的甾體化合物濃度對(duì)微生物具有一定毒害作用,會(huì)抑制其酶的活力[20]。CONTENTE M L等[10]也在坎利酮液態(tài)發(fā)酵的轉(zhuǎn)化研究中表明,只有當(dāng)?shù)孜餄舛缺３衷?～6 g/L時(shí)才會(huì)達(dá)到高轉(zhuǎn)化率,高濃度底物不僅會(huì)限制轉(zhuǎn)化率,也會(huì)由于羥基化發(fā)生的碳位不同而產(chǎn)生副產(chǎn)物。因此選擇底物添加量10%為宜。

2.7 固態(tài)發(fā)酵轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)

基于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中各組分的單因素試驗(yàn)結(jié)果,以轉(zhuǎn)化率為指標(biāo),選定葡萄糖、(NH4)2SO4、甘氨酸、料水比、底物添加量進(jìn)行正交試驗(yàn),得到轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的最佳組成條件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2,方差分析見表3。

表2 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal tests for medium formula optimization

由表2可知,各因素影響轉(zhuǎn)化率的主次順序?yàn)锳＞D＞C＞E＞B,即葡萄糖添加量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響最大,其次為料水比、甘氨酸添加量和底物添加量,氮源添加量對(duì)轉(zhuǎn)化率影響最小。從K值可知,最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方組合為A3B1C3D3E4,即培養(yǎng)基組成為葡萄糖1.0%,硫酸銨0.6%,甘氨酸0.8%,料水比為1.0∶1(g∶mL),底物添加量為12%。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),最終轉(zhuǎn)化率可達(dá)94.21%。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

由表3可知,葡萄糖和甘氨酸的添加量以及培養(yǎng)基料水比對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響顯著(P＜0.05),其余因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不顯著(P＞0.05)。

3 結(jié)論

對(duì)根霉轉(zhuǎn)化坎利酮生成11α-羥基坎利酮的固態(tài)發(fā)酵轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了條件優(yōu)化,優(yōu)化后的坎利酮發(fā)酵轉(zhuǎn)化條件為:葡萄糖1%,硫酸銨0.6%,甘氨酸0.8%,料水比為1.0∶1(g∶mL),底物添加量為12%。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn),在最佳工藝條件下,轉(zhuǎn)化率可達(dá)到94.21%,高于前期研究。本研究證明了固態(tài)發(fā)酵轉(zhuǎn)化坎利酮的可行性,且轉(zhuǎn)化率高于液態(tài)發(fā)酵時(shí)坎利酮的轉(zhuǎn)化率,同時(shí)極大簡(jiǎn)化了底物轉(zhuǎn)化和產(chǎn)物提取過(guò)程,解決了液態(tài)發(fā)酵對(duì)于甾體底物溶解性的局限,具有應(yīng)用前景。

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