云月英,馬宇南,王文龍

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué) 后勤處,內(nèi)蒙古 包頭 014010)

膽固醇在人體內(nèi)具有重要的生理作用,但血清膽固醇水平過(guò)高會(huì)增加心血管疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。近年來(lái),隨著國(guó)民生活方式和膳食結(jié)構(gòu)類(lèi)型的轉(zhuǎn)變,我國(guó)居民心血管疾病的患病率持續(xù)上升,對(duì)人體健康造成了巨大的影響,成為城鄉(xiāng)居民死亡的首要原因[3]。據(jù)報(bào)道,血清膽固醇水平下降1%,冠心病的患病風(fēng)險(xiǎn)可降低2%～3%[4]。所以,選擇恰當(dāng)?shù)姆椒ń档蜕攀臣把逯心懝檀嫉乃接葹橹匾?/p>

利用微生物降膽固醇因具有高效、低成本、安全性高等特點(diǎn),受到研究者的廣泛關(guān)注[5]。乳酸菌是發(fā)酵肉制品生產(chǎn)中最常用的發(fā)酵劑,研究表明其中的一些菌株具有高效降膽固醇的能力,如植物乳桿菌[6-7]、戊糖片球菌[8]、消化乳桿菌[9]等。目前認(rèn)為,乳酸菌主要通過(guò)共沉淀作用、菌體對(duì)膽固醇的同化吸收作用以及兩者協(xié)同作用等方式來(lái)發(fā)揮其降膽固醇的功效[10]。因此,選育具有降低膽固醇能力的乳酸菌菌株,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行研究,對(duì)于乳酸菌在功能性發(fā)酵肉制品中的應(yīng)用具有重要的意義[11]。

本研究通過(guò)鄰苯二甲醛法測(cè)定膽固醇的含量,對(duì)來(lái)源于自然發(fā)酵肉制品中的乳酸菌的體外降膽固醇特性進(jìn)行初步研究,篩選出降膽固醇性能優(yōu)良的菌株并進(jìn)行鑒定,為功能性肉制品發(fā)酵劑的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株:從自然發(fā)酵肉制品中分離篩選[12],編號(hào)為M5、M6、M7、M8、M9、M12、M14、M15、M16、M18、M21、M23、M24。

鄰苯二甲醛、蔗糖脂肪酸酯:北京索萊寶科技有限公司；牛膽鹽:天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；膽固醇:美國(guó)Sigma公司。所有試劑均為分析純。

MRS肉湯培養(yǎng)基:廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

高膽固醇MRS液體培養(yǎng)基:膽固醇0.1 g,蔗糖脂肪酸酯0.1 g,牛膽鹽0.2 g,1 mL吐溫-80,置于小燒杯中,攪拌均勻,加入5 mL冰乙酸,60℃水浴中溶解,超聲波間歇處理15 min,快速加入1 000 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中,即為含0.1 mg/mL膽固醇膠束的高膽固醇MRS液體培養(yǎng)基[13]。

1.2 儀器與設(shè)備

PSX智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱:寧波萊?？萍加邢薰?；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái):上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；F200顯微鏡:上海長(zhǎng)方光學(xué)儀器廠；R20BC臺(tái)式高速冷凍離心機(jī):湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；YXQ-LS-30SII立式壓力滅菌器:上海東亞壓力容器制造有限公司；JA5003電子分析天平:上海超平科技儀器有限公司；UV-7504單光束-可見(jiàn)分光光度計(jì):上海欣茂儀器有限公司；JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī):寧波新芝生物科技股份有限公司；CX-AG050厭氧罐:上海川翔生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 降膽固醇乳酸菌的初篩

供試菌液按4%(V/V)的接種量接種于高膽固醇MRS液體培養(yǎng)基中,37℃厭氧培養(yǎng)24h,離心(12000r/min、4℃、10 min),測(cè)定上清液中膽固醇的含量,以未接菌的高膽固醇MRS液體培養(yǎng)基為對(duì)照,計(jì)算膽固醇去除率[14]。

1.3.2 菌體的同化吸收及共沉淀試驗(yàn)

供試菌液按4%(V/V)的接種量接種于高膽固醇MRS液體培養(yǎng)基中,37℃厭氧培養(yǎng)24h,離心(12000r/min、4℃、10min),取上清液；傾出剩余上清液,加入0.1mol/L、pH7.0的Na2HPO4/NaH2PO4緩沖液5 mL,混勻后離心(12 000 r/min、4℃、10 min),取上清液為菌體洗滌液；傾出剩余菌體洗滌液,再加入0.1mol/L、pH7.0的Na2HPO4/NaH2PO4緩沖液5mL,于冰浴條件下超聲波破碎細(xì)胞,離心(12 000 r/min、4℃、10min),取上清液為菌體破碎液。以未接種的高膽固醇MRS液體培養(yǎng)基為對(duì)照,分別測(cè)定上清液、洗滌液和破碎液中的膽固醇含量[14]。

1.3.3 膽鹽對(duì)菌體降膽固醇能力的影響

將上述高膽固醇MRS液體培養(yǎng)基中牛膽鹽的添加量調(diào)整為0、3g,其他成分不變,即得膽鹽質(zhì)量濃度為0、0.3g/100mL的高膽固醇MRS液體培養(yǎng)基。供試菌液按4%(V/V)的接種量分別接種于這兩種培養(yǎng)基中,37℃厭氧培養(yǎng)24 h,離心(12 000 r/min、4℃、10 min),測(cè)定上清液中膽固醇含量,以未接菌的高膽固醇MRS液體培養(yǎng)基為對(duì)照,計(jì)算膽固醇去除率[15]。

1.3.4 菌體細(xì)胞對(duì)超聲波的抗性

供試菌液按4%(V/V)的接種量分別接種于MRS液體培養(yǎng)基、膽鹽質(zhì)量濃度為0和0.3 g/100 mL的高膽固醇MRS液體培養(yǎng)基中,37℃厭氧培養(yǎng)24h,離心(12000r/min、4℃、10 min),收集菌體,用5 mL無(wú)菌生理鹽水懸浮,菌懸液置于冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎,取破碎前后的菌懸液,采用平板計(jì)數(shù)法,計(jì)算菌體存活率[16]。

1.3.5 熱滅活細(xì)胞和休眠細(xì)胞的降膽固醇作用

取等量供試菌液,一份121℃滅菌15 min,離心(12 000 r/min、4℃、10 min),收集菌體,然后加入5 mL高膽固醇MRS液體培養(yǎng)基；另一份同樣條件下離心,菌體重懸浮于5 mL含相同濃度膽固醇膠束的0.05 mol/L,pH 6.8的磷酸鹽緩沖液中?？瞻撞唤臃N菌體,37℃厭氧培養(yǎng)24 h,離心(12 000 r/min、4℃、10 min),測(cè)定上清液中膽固醇含量,計(jì)算膽固醇去除率[17]。

1.3.6 16S rRNA分子生物學(xué)鑒定

采用Axygen細(xì)菌基因組DNA小量制備試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA。以細(xì)菌基因組DNA為模版,用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)進(jìn)行16S rRNA基因序列擴(kuò)增。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)條件:95℃、5 min；95℃、30 s,58℃、30 s,72℃、90 s,35個(gè)循環(huán)；72℃、7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析后送上海派森諾生物科技股份有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在NCBI基因庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源性分析。

1.3.7 測(cè)定方法

膽固醇含量的測(cè)定:根據(jù)參考文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行測(cè)定,其計(jì)算公式如下:

式中:C0為未接種菌株培養(yǎng)基中膽固醇含量,μg/mL；C1為實(shí)驗(yàn)菌株發(fā)酵上清液中膽固醇含量,μg/mL。

式中:N0為超聲波破碎前菌懸液的活菌數(shù),CFU/mL；N1為超聲波破碎后菌懸液的活菌數(shù),CFU/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 降膽固醇乳酸菌初篩結(jié)果

待測(cè)菌株對(duì)培養(yǎng)基中膽固醇的去除率如表1所示。

表1 乳酸菌降膽固醇能力Table 1 Cholesterol-degrading capability of lactic acid bacteria

由表1可知,不同菌株的降膽固醇能力有很大的差異,膽固醇去除率為4.70%～49.11%,其中菌株M12、M18、M21和M23的去除率＞40%。乳酸菌對(duì)胃腸道的耐受性是其發(fā)揮生理功能的關(guān)鍵因素[19]。菌株耐受性實(shí)驗(yàn)表明,菌株M12和M23分別在pH值為3.0的MRS液體培養(yǎng)基、含0.3g/100mL膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基以及人工模擬胃腸道環(huán)境中顯示出較好的耐受性,而M18和M21的耐受性較差。綜合以上結(jié)果,選擇菌株M12和M23為目標(biāo)菌株,對(duì)其降膽固醇的機(jī)理進(jìn)行初步的探討。

2.2 菌體的同化吸收及共沉淀試驗(yàn)

圖1 菌株M12、M23培養(yǎng)液各部分的膽固醇含量Fig.1 Cholesterol contents in all parts of culture solution of strains M12 and M23

由圖1可知,原培養(yǎng)液中23.20%和30.10%的膽固醇存在于受試菌體的洗滌液中,25.26%和19.40%的膽固醇存在于菌體破碎液中。菌體洗滌液中的膽固醇主要來(lái)自膽鹽與膽固醇的共沉淀,破碎液中的膽固醇主要來(lái)自菌體細(xì)胞對(duì)膽固醇的同化吸收。因此,這兩株菌都是依靠同化吸收作用與膽鹽共沉淀作用協(xié)同來(lái)降低培養(yǎng)基中的膽固醇含量,且菌株M23的共沉淀作用高于同化吸收作用。

2.3 膽鹽對(duì)菌體降膽固醇能力的影響

圖2 牛膽鹽對(duì)菌株M12、M23降膽固醇能力的影響Fig.2 Effect of bile salt on cholesterol-degrading capability of strains M12 and M23

研究表明[20-21],添加一定量的膽鹽可與膽固醇發(fā)生共沉淀作用,同時(shí)還可以增加菌體細(xì)胞的通透性,利于其對(duì)膽固醇的吸收,從而提高菌體細(xì)胞的降膽固醇能力。通常認(rèn)為人體腸道膽鹽濃度平均為0.3g/100mL[22]。因此,在培養(yǎng)基中添加0.3 g/100 mL的牛膽鹽研究其對(duì)菌體去除膽固醇能力的影響。由圖2可知,在不添加膽鹽時(shí),菌株M12和M23的膽固醇去除率僅為18.29%和20.36%；當(dāng)添加0.3 g/100 mL的牛膽鹽時(shí),菌株對(duì)膽固醇的去除能力顯著升高(P＜0.01),去除率分別為56.05%和58.49%。

2.4 菌體對(duì)超聲波的抗性

圖3 菌株M12、M23對(duì)超聲波的抗性Fig.3 Resistance of strains M12 and M23 to ultrasonic wave

由圖3可知,菌株M12和M23在3種培養(yǎng)基中對(duì)超聲波的耐受性有明顯的差異(P＜0.05),在未添加膽固醇的培養(yǎng)基中存活率僅為18.00%和22.22%,在加入膽固醇的培養(yǎng)基中存活率提高為22.45%和27.21%,這可能與菌體細(xì)胞吸收膽固醇,增強(qiáng)細(xì)胞膜的抗性有關(guān)[23]。在同時(shí)添加膽固醇和牛膽鹽的培養(yǎng)基中菌株的存活率進(jìn)一步提高,可達(dá)到32.09%和37.93%,可能是因?yàn)樘砑幽扄}可增強(qiáng)菌體對(duì)膽固醇的吸收,從而使細(xì)胞膜的抗性更強(qiáng),這與上述實(shí)驗(yàn)中添加膽鹽提高了菌體對(duì)膽固醇的去除能力結(jié)果相符。

2.5 熱滅活菌體和休眠菌體的降膽固醇作用

表2 熱滅活菌體和休眠菌體的降膽固醇作用Table 2 Cholesterol-degrading capability of the thermal inactivated cells and dormant cells

由表2可知,菌株M12和M23的休眠菌體對(duì)膽固醇的去除率較高,雖然與上述活菌體相比有一定的下降,但仍可達(dá)到30%以上。熱滅活菌體也具有一定的去除膽固醇的能力,但去除率較低,僅為10%左右。以上結(jié)果表明菌體細(xì)胞的降膽固醇作用與其生長(zhǎng)狀態(tài)有關(guān),菌體細(xì)胞生長(zhǎng)越旺盛,降膽固醇能力越強(qiáng),這與劉長(zhǎng)建等[24]報(bào)道的結(jié)論一致。

2.6 菌株16S rRNA序列分析

圖4 菌株M12、M23的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoretograms of PCR products of strains M12 and M23

由圖4所示,對(duì)菌株M12、M23的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析,得到大小約為1 500 bp的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,測(cè)序片段長(zhǎng)度分別為1 496 bp、1 509 bp,符合16S rRNA序列長(zhǎng)度。將獲得的序列在NCBI上進(jìn)行BLAST同源性分析,這2株菌分別與彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)和戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)有99%的同源性。因此確定菌株M12為彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus),菌株M23為戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。

3 結(jié)論

對(duì)自然發(fā)酵肉制品中分離出的13株乳酸菌的體外降膽固醇能力進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果顯示其去除率差別較大,為4.70%～49.11%。選擇其中膽固醇去除率較高且耐受性較好的2株菌作為目標(biāo)菌株,進(jìn)一步探討其降膽固醇的作用機(jī)理。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),2株菌的降膽固醇機(jī)制為同化吸收和共沉淀協(xié)同作用；添加0.3 g/100 mL膽鹽可顯著增加菌體對(duì)膽固醇的去除作用(P＜0.01),去除率分別為56.05%和58.49%；添加膽固醇和膽鹽均可顯著提高菌株經(jīng)超聲波處理后的存活率(P＜0.05),存活率分別為32.09%和37.93%；2株菌的熱滅活菌體和休眠菌體也具有一定的膽固醇去除能力,且休眠菌體的去除率高于熱滅活菌體。經(jīng)16SrRNA序列分析,菌株M12為彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus),菌株M23為戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。對(duì)于菌株M12和M23的降膽固醇影響因素、體內(nèi)降膽固醇能力及作為發(fā)酵劑在肉制品中的應(yīng)用等問(wèn)題,仍需進(jìn)一步研究。

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