王晨慧,饒 靜,2,辛 鵬,2,李春揚(yáng),2,張曉磊,2*,尹建軍,2,宋全厚,2

(1.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京 100015；2.國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,北京 100015)

山藥是一種藥食同源的保健佳蔬,具有獨(dú)特的藥用和保健價(jià)值[1]。隨著人們對(duì)保健和功能性食品需求的不斷上升,以山藥為原料,經(jīng)現(xiàn)代生物技術(shù)手段發(fā)酵而成的山藥酒,不僅可以最大程度的保留山藥中的活性成分,還可通過微生物的代謝合成多種有益物質(zhì),越來越受到消費(fèi)者的青睞。近年來,食品中的活性功能成分日益受到關(guān)注,已成為熱門的研究課題,薯蕷皂苷作為山藥特有的活性成分,具有明顯的抗腫瘤作用[2],在治療心血管疾病、腦炎、皮膚病方面也有顯著效果[3],其研究多集中于山藥或其他制品[4-5],在山藥酒中則未見報(bào)道,檢測(cè)技術(shù)的缺失,極易導(dǎo)致對(duì)活性功能成分的過分夸大,影響行業(yè)健康有序的發(fā)展,因此,本研究旨在建立山藥酒中薯蕷皂苷的檢測(cè)技術(shù),并對(duì)市售山藥酒中薯蕷皂苷含量進(jìn)行分析比較,以填補(bǔ)資料空白,為提高產(chǎn)品品質(zhì)、促進(jìn)行業(yè)科技進(jìn)步與良性健康發(fā)展提供有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6種山藥酒樣品(1種發(fā)酵原酒、4種山藥發(fā)酵酒和1種以山藥為原料的黃酒,品牌A、品牌B,分別編號(hào)為1#、2#、3#、4#、5#、6#):市售。

三氯甲烷、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀(均為分析純)、鹽酸(純度≥98%):北京化工廠；纖維素酶(100 U/mg)、淀粉酶(50 U/mg)、甲醇、乙腈(均為色譜純)、薯蕷皂苷對(duì)照品(純度≥98%):上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters高效液相色譜儀(high performance liquid chromatograph,HPLC)(配有2487UVD紫外檢測(cè)器):美國(guó)Waters公司；Milli-Q Reference超純水發(fā)生器:美國(guó)Millipore公司；AL204-IC萬分之一天平:梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解液制備

取200 mL山藥酒于蒸發(fā)皿中,蒸發(fā)濃縮至5 mL左右,置于磷酸緩沖溶液中,加入一定量的酶(酶用量按濃縮前山藥酒取樣量計(jì)算),在一定溫度條件下酶解一段時(shí)間,加入100 mL的5%鹽酸-甲醇溶液(1∶1,V/V),沸水浴條件下回流5 h,冷卻至室溫后,調(diào)節(jié)pH=8,在55℃條件下旋蒸至30 mL,用50 mL三氯甲烷萃取3次,萃取后的有機(jī)相旋蒸近干,用2 mL甲醇溶解,過膜于色譜瓶中待測(cè)。

1.3.2 單因素試驗(yàn)優(yōu)化山藥酒酶解液制備工藝

量取200 mL山藥酒于蒸發(fā)皿中,蒸發(fā)濃縮后,置于磷酸緩沖溶液中,分別考察酶的種類(淀粉酶、纖維素酶、復(fù)合酶(纖維素酶∶淀粉酶酶活力比=1∶1))、酶用量(0.5 U/mL、1 U/mL、2 U/mL、3 U/mL、4 U/mL)、酶解初始pH值(2.5、5.0、5.8、6.8、7.8)、酶解時(shí)間(3 h、6 h、12 h、24 h、48 h)、酶解溫度(35℃、40℃、45℃、50℃、55℃)等因素對(duì)山藥酒中薯蕷皂苷含量的影響。

1.3.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化山藥酒酶解液制備工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以薯蕷皂苷含量為考察指標(biāo),利用L9(34)正交試驗(yàn)分別考察復(fù)合酶用量(A)、酶解時(shí)間(B)、酶解溫度(C)、酶初始pH值(D)對(duì)薯蕷皂苷含量的影響。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 山藥酒酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiments for enzymolysis conditions of yam wine

1.3.4 測(cè)定方法

采用高效液相色譜法測(cè)定薯蕷皂苷含量。色譜條件[6-10]為InertsilRODS-3色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相:乙腈-水(50∶50,V/V)；流速:1.0 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng):203 nm；柱溫:30℃；進(jìn)樣量:10 μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為1 g/L薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,再用甲醇分別配制成5mg/L、10mg/L、25mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L的薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)工作液。以薯蕷皂苷的峰面積(y)為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,經(jīng)線性回歸,回歸方程為:y=2979.9x-11600；相關(guān)系數(shù)R為0.998 9,表明薯蕷皂苷在4.91～196.40 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶種類的選擇

薯蕷皂苷在植物體內(nèi)多與糖以糖苷鍵的形式結(jié)合成甙,強(qiáng)酸和酶都可以破壞薯蕷皂甙的糖苷鍵,有利于薯蕷皂苷的分離。目前,薯蕷皂苷的提取方法主要有直接酸解法[11]、超聲提取法[12]、回流提取法[6]和酶解法[13-15],而酶解法可采用溫和的方式有效降解糖苷鍵,對(duì)薯蕷皂苷的提取效果優(yōu)于超聲提取法和回流提取法。本研究采用淀粉酶、纖維素酶和復(fù)合酶解法(纖維素酶∶淀粉酶酶活力比=1∶1)進(jìn)行提取,以薯蕷皂苷的含量為指標(biāo),確定山藥酒中薯蕷皂苷的最佳提取方法,試驗(yàn)結(jié)果如圖1。

圖1 單一酶解法與復(fù)合酶解法試驗(yàn)結(jié)果比較Fig.1 Comparison of experimental results of single and complex enzyme methods

由圖1可知,復(fù)合酶解法提取薯蕷皂苷的效果優(yōu)于單一酶解法,且采用復(fù)合酶解法得到的皂苷含量為1.147 mg/L,因此,選擇復(fù)合酶解法進(jìn)行樣品提取。

2.1.2 復(fù)合酶用量對(duì)薯蕷皂苷含量的影響

圖2 復(fù)合酶用量對(duì)薯蕷皂苷含量的影響Fig.2 Effect of complex enzyme addition on the content of diosgenin

由圖2可知,薯蕷皂苷的含量隨復(fù)合酶用量的增加呈先增加后趨于平緩的趨勢(shì),當(dāng)復(fù)合酶用量為2 U/mL時(shí),薯蕷皂苷的含量最大,為1.143 mg/L,繼續(xù)增加酶用量,薯蕷皂苷含量略有下降。這可能與酶量增加到一定程度時(shí),酶分子過于飽和,一部分酶不能與底物結(jié)合,使得水解速度變慢,從而導(dǎo)致薯蕷皂苷濃度降低相關(guān)。因此選擇復(fù)合酶用量為2 U/mL進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3 酶解初始pH值對(duì)薯蕷皂苷含量的影響

由圖3可知,薯蕷皂苷的含量隨酶解初始pH值的升高呈先增加后減少的趨勢(shì),當(dāng)酶解初始pH值為5.0時(shí)有利于復(fù)合酶發(fā)揮最大活力,薯蕷皂苷的含量最高,繼續(xù)升高pH值,薯蕷皂苷含量開始減少。過高或過低都不利于酶解作用,浸提效率降低。因此選擇酶解初始pH值為5.0進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 酶解初始pH值對(duì)薯蕷皂苷含量的影響Fig.3 Effect of enzymolysis initial pH on the content of diosgenin

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)薯蕷皂苷含量的影響

圖4 酶解時(shí)間對(duì)薯蕷皂苷含量的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on the content of diosgenin

由圖4可知,薯蕷皂苷含量隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增加后緩慢減少的趨勢(shì),當(dāng)酶解時(shí)間為9 h時(shí),薯蕷皂苷含量達(dá)到最大值。繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間,薯蕷皂苷含量反而下降,這可能由于發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng),薯蕷皂苷本身結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分解,從而影響酸解后薯蕷皂苷含量的測(cè)定。因此選擇酶解時(shí)間為9 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.5 酶解溫度對(duì)薯蕷皂苷含量的影響

圖5 酶解溫度對(duì)薯蕷皂苷含量的影響Fig.5 Effect of enzymolysis temperature on the content of diosgenin

由圖5可知,薯蕷皂苷含量隨著酶解溫度的升高呈先增加后減少的趨勢(shì),當(dāng)酶解溫度為45℃時(shí),薯蕷皂苷含量最高,達(dá)到1.145 mg/L,然而繼續(xù)升高酶解溫度時(shí),薯蕷皂苷含量開始下降。這可能由于溫度過高導(dǎo)致復(fù)合酶部分失活或影響了其協(xié)同作用,從而影響山藥酒中薯蕷皂苷的提取效率。因此選擇酶解溫度為45℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過L9(34)正交試驗(yàn)確定最佳條件,正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2。

表2 山藥酒酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for enzymolysis conditions of yam wine

由表2可知,根據(jù)R值對(duì)酶解影響因素排序?yàn)閺?fù)合酶用量＞酶解初始pH值＞酶解時(shí)間＞酶解溫度,根據(jù)正交試驗(yàn)極差分析確定最優(yōu)條件為A2B3C1D2,即復(fù)合酶用量為2U/mL,酶解時(shí)間為12 h,酶解溫度為40℃,酶解初始pH值為5.0。在此條件下,薯蕷皂苷含量為1.158 mg/L。

2.3 樣品測(cè)定結(jié)果

采用上述方法對(duì)市售2個(gè)品牌的6種山藥酒中薯蕷皂苷的含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見表3。對(duì)照品及典型樣品高效液相色譜分析圖譜見圖6。

表3 市售山藥酒中薯蕷皂苷含量的測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of diosgenin content in commercial yam wine

由表3可知,6種樣品中薯蕷皂苷含量范圍為0.106～1.156 mg/L。山藥發(fā)酵原酒(1#)中薯蕷皂苷含量最高,為1.156 mg/L；4種山藥發(fā)酵酒(2#、3#、4#、5#)薯蕷皂苷含量均低于以山藥為原料的黃酒(6#)；品牌A的3種山藥發(fā)酵酒(2#、3#、4#)中薯蕷皂苷含量接近,品質(zhì)較為穩(wěn)定。上述結(jié)果為深入研究山藥酒中薯蕷皂苷及其他活性功能成分提供了有價(jià)值的數(shù)據(jù)參考。

圖7 對(duì)照品(A)及典型樣品(B)高效液相色譜色譜圖Fig.7 Chromatography of reference substances(A)typical samples(B)analysis by HPLC

3 結(jié)論

本研究確立復(fù)合酶法結(jié)合液相色譜測(cè)定山藥酒中薯蕷皂苷的方法,酶解條件為復(fù)合酶用量為2U/mL,酶解時(shí)間為12 h,酶解溫度為40℃,酶解初始pH值為5.0。采用InertsilRODS-3色譜柱(250 nm×250 nm,5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-水(50∶50,V/V)；流速1.0mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm。采用這一技術(shù)對(duì)市售2種品牌6種山藥酒產(chǎn)品進(jìn)行測(cè)定,薯蕷皂苷含量范圍為0.106～1.156 mg/L。本研究所建立的方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠,適用于山藥酒中活性功能成分薯蕷皂苷的檢測(cè),可為提高產(chǎn)品品質(zhì)提供有力的數(shù)據(jù)支撐和技術(shù)手段。

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