易曉成,萬 萍*,白 娜

(1.四川工商職業(yè)技術學院 酒類與食品工程系,四川 都江堰 611830；2.成都大學藥學與生物工程學院,四川 成都 610106)

青稞是禾本科大麥屬的一種作物,主要分布在我國的青藏高寒地區(qū)[1]。青稞除含有豐富的碳水化合物、蛋白質和人體必需氨基酸外,還含有多種維生素,銅、鋅、錳等20余種礦物元素[2-3],是谷類作物中的佳品。它不僅是藏族人民重要的糧食,還具有其獨到的藥效,如除濕、止瀉等,可用于治療相關的疾病[4-5]。同時,由于青稞具有較高含量的β-葡聚糖,對降膽固醇、降血糖貢獻巨大[6-7]。因此,也成為食品加工的一個新的研究方向。

益生菌能促進宿主腸道菌群的生態(tài)平衡[8],其發(fā)酵所產(chǎn)生的乳酸是一種天然的防腐保鮮劑,可保持活性益生菌的穩(wěn)定性、安全性,并能賦予產(chǎn)品酸爽的口感；同時,益生菌發(fā)酵所產(chǎn)生的乳酸菌素能有效地抑制病原菌和腐敗菌；另外,益生菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的種種生物活性物質具有降低膽固醇、降血糖、改善肝功能、提高免疫力等多重保健功能,對身體健康發(fā)揮著積極的作用[9-10]。目前青稞除用作口糧、焙烤食品和釀酒的原料外,青稞發(fā)酵飲料鮮有報道,國內(nèi)僅馬長中等[11]采用單一乳酸菌LAB005證明了乳酸菌發(fā)酵青稞飲料是可行的,而采用益生菌(保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌)發(fā)酵青稞飲料的研究國內(nèi)外尚鮮見報道。

以青稞為原料,利用酶工程技術得到含有適量碳源和氮源的青稞酶解液[12]。本研究以該青稞酶解液為原料,研究不同的發(fā)酵時間、發(fā)酵起始pH、發(fā)酵溫度、益生菌接種量等因素對發(fā)酵的影響；并以發(fā)酵酸度為響應值,采用響應面法對益生菌發(fā)酵青稞飲料的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化,以期為青稞飲料的研發(fā)提供參考,對青稞的有效開發(fā)及產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到積極的推動作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青稞:市售；直投式益生菌發(fā)酵劑(保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)與嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)):北京川秀科技有限公司；碳酸鈉(分析純):成都市科龍化工試劑廠；青稞酶解液:本實驗室提供。

1.2 儀器與設備

GNP-9270型恒溫培養(yǎng)箱:上海齊欣科技有限公司；LD型電子天平:沈陽龍騰電子有限公司；pHS-3C型酸度計:成都世紀方舟科技有限公司；SW-CJ-2D型無菌操作臺:蘇州凈化設備有限公司；HH型恒溫水浴鍋:金壇市金城國勝實驗儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 益生菌發(fā)酵青稞飲料工藝流程

1.3.2 操作要點

接種:將試驗所需的器材在0.1MPa(121～126℃)條件下滅菌15min；取青稞酶解液,用10%的碳酸鈉溶液調節(jié)pH,每組分裝50 mL后在沸水浴中殺菌10 min,冷卻至40℃左右,在無菌操作臺上接種直投式益生菌發(fā)酵劑,振蕩均勻。

恒溫發(fā)酵:按照單因素試驗設計的方案,將接種后的青稞酶解液置于恒溫培養(yǎng)箱中,發(fā)酵一定時間后,測定發(fā)酵液的酸度。

調配:按照本實驗室研究得出的工藝配方,加入蔗糖進行調味,并加入復配穩(wěn)定劑得到成品[13]。

1.3.3 試驗設計

(1)單因素試驗設計

試驗選取發(fā)酵時間(8h、16h、24h、32h、40h、48h、56h、64 h、72 h、80 h、88 h)、發(fā)酵起始pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、接種量(3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%)、發(fā)酵溫度(36℃、38℃、40℃、42℃、44℃)等因素分別進行試驗,以探討其對發(fā)酵液酸度的影響。

(2)響應面優(yōu)化試驗設計

在單因素試驗的基礎上,根據(jù)中心組合試驗設計(centralcomposite design,CCD)原理,以發(fā)酵液酸度為響應值,使用Design-Expert8.0.5軟件,選取發(fā)酵溫度(A)、發(fā)酵起始pH值(B)及接種量(C)為自變量,采用3因素3水平的響應面法對試驗結果進行優(yōu)化,以確定最佳的發(fā)酵工藝條件[14-15]。試驗因素與水平見表1。

表1 飲料發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for beverage fermentation technology optimization

1.3.4 檢測方法

酸度的測定:電位滴定法[16]；pH值的測定:酸度計法[17]；還原糖含量的測定:直接滴定法[18]；氨基酸含量的測定:甲醛滴定法[18]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 發(fā)酵時間的確定

發(fā)酵時間的長短直接影響益生菌發(fā)酵生成乳酸的量以及發(fā)酵的完全程度。在發(fā)酵起始pH 7.0,接種量4.5%,發(fā)酵溫度40℃的條件下,探討了不同發(fā)酵時間對發(fā)酵液酸度的影響,其結果見圖1。

圖1 發(fā)酵時間對發(fā)酵液酸度的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the acidity of fermentation broth

由圖1可知,發(fā)酵液的酸度隨著發(fā)酵時間的增加而增大,當達到72 h后,雖然酸度有所增加,但增幅不大,基本趨于穩(wěn)定,故確定最適發(fā)酵時間為72 h,此時發(fā)酵液的酸度達到64.6°T。

2.1.2 發(fā)酵起始pH的確定

益生菌的生長需要特定的pH來維系細胞內(nèi)各種生物活性分子的結構穩(wěn)定,同時胞內(nèi)酶也需要一個最適的pH值來維持其活性[19]。益生菌生長pH范圍一般為5.0～7.5,且隨著發(fā)酵的進行,pH值不斷降低,將對益生菌的生長更加不利[20],因此需要確定一個起始pH使益生菌更好地生長和發(fā)酵。在接種量4.5%,發(fā)酵溫度40℃,發(fā)酵時間72 h的條件下,探討了不同發(fā)酵起始pH對發(fā)酵液酸度的影響,其結果見圖2。

圖2 發(fā)酵起始pH對發(fā)酵液酸度的影響Fig.2 Effect of initial pH on acidity of fermentation broth

由圖2可知,在其他發(fā)酵條件一定的情況下,起始pH在6.0～7.0時發(fā)酵液的酸度隨著起始pH值的增加而呈現(xiàn)上升趨勢,當起始pH在7.0～8.0時發(fā)酵液的酸度隨著起始pH值的增加而減小,在起始pH值為7.0時發(fā)酵液酸度達到最大(65.0°T)。當環(huán)境偏酸或偏堿,使益生菌內(nèi)酶的活力降低,生長能力變?nèi)?產(chǎn)酸的能力也就變?nèi)鮗20],因此確定pH值7.0為益生菌生長的最適發(fā)酵起始pH。

2.1.3 接種量的確定

接種量大小不僅直接影響到益生菌發(fā)酵青稞飲料的發(fā)酵速率,而且對最終產(chǎn)品的風味也會產(chǎn)生決定性的影響[21]。在發(fā)酵起始pH 7.0,發(fā)酵溫度40℃,發(fā)酵時間72 h的條件下,探討了不同接種量對益生菌發(fā)酵液酸度的影響,其結果見圖3。

圖3 接種量對發(fā)酵液酸度的影響Fig.3 Effect of inoculum on acidity of fermentation broth

由圖3可知,在其他發(fā)酵條件一定的情況下,當接種量在3.5%～4.5%時,發(fā)酵液酸度隨著接種量的增大而增大,當接種量在4.5%～5.0%時,發(fā)酵液酸度隨著接種量的增大而減小,接種量繼續(xù)增加到5.5%時,發(fā)酵液酸度不再變化,在接種量為4.5%時發(fā)酵液酸度達到最大值(63.0°T)。此時底物濃度與益生菌的比例達到最佳,發(fā)酵酸度達到最大；當接種量低于或高于4.5%時,均會影響乳酸的生成。因此確定4.5%為最適接種量。

2.1.4 發(fā)酵溫度的確定

發(fā)酵溫度影響到益生菌的生長進而影響發(fā)酵的速度和乳酸的積累。在發(fā)酵起始pH7.0,接種量4.5%,發(fā)酵時間72 h的條件下,探討了不同發(fā)酵溫度對益生菌發(fā)酵液酸度的影響,其結果見圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對發(fā)酵液酸度影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the acidity of fermentation broth

由圖4可知,在其他發(fā)酵條件一定的情況下,發(fā)酵溫度在36～40℃時,發(fā)酵液的酸度隨著發(fā)酵溫度的升高而增大,當發(fā)酵溫度在40～44℃時,發(fā)酵液的酸度隨著發(fā)酵溫度的升高反而減小,當發(fā)酵溫度為40℃時,酸度達到最大(66.0°T)。發(fā)酵溫度過低或過高均會抑制益生菌的生長,從而產(chǎn)酸能力降低,產(chǎn)酸量也就小。因此確定40℃為最適發(fā)酵溫度。

2.2 響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應面方案設計與結果

根據(jù)中心組合試驗設計(centralcompositedesign,CCD)原理,綜合單因素試驗結果,使用Design-Expert8.0.5軟件,選取發(fā)酵溫度(A)、發(fā)酵起始pH值(B)、接種量(C)為自變量,以發(fā)酵液酸度(Y)為響應值,設計了3因素3水平的響應面試驗組,響應面試驗結果見表2,方差分析見表3。

表2 飲料發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface experiments for beverage fermentation technology optimization

用Design-Expert 8.0.5軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,得到試驗因素對酸度的回歸方程如下:

由表3可知,該模型的F值87.65,P＜0.000 1,回歸模型極其顯著；A、B、C、A2、B2、C2對酸度影響極顯著(P＜0.01),AB、AC、BC對產(chǎn)酸的交互效應影響分別是極顯著(P＜0.01)、顯著(P＜0.05)和不顯著(P＞0.05)。失擬項P=0.1238＞0.05不顯著,說明該模型與純誤差關聯(lián)不顯著,該方案可用于實際生產(chǎn)。根據(jù)表3擬合回歸方程的復相關系數(shù)R2為0.987 5,說明該模型擬合程度很好,誤差小,試驗條件的選擇適宜。

2.2.2 響應面結果分析及最佳工藝驗證

采用Design-Expert8.0.5軟件獲得三維響應面和等高線圖,能夠直觀地反映出各因素及其相互作用對試驗結果的影響,結果見圖5。

由圖5a可知,發(fā)酵溫度(A)對酸度的影響要大于接種量(C)對酸度的影響；等高線圖中橢圓度較大,說明AC兩因素之間交互影響顯著(P＜0.05)；由圖5b可知,發(fā)酵起始pH值(B)對酸度的影響比發(fā)酵溫度(A)更明顯(P＜0.01)；等高線圖中橢圓度很大,說明AB兩因素之間交互影響極顯著；由圖5c可知,發(fā)酵起始pH值(B)比接種量(C)的對酸度的影響大；等高線圖的橢圓度的較小,說明BC兩因素之間交互作用不顯著(P＞0.05)。

經(jīng)Design-Expert8.0.5軟件優(yōu)化處理后,得到益生菌發(fā)酵青稞發(fā)酵飲料的最佳工藝條件為:發(fā)酵溫度41.05℃,發(fā)酵起始pH值7.25,接種量4.69%。將響應面優(yōu)化方案修約后的工藝條件進行3組平行試驗即:在發(fā)酵起始pH值7.3,接種量4.7%,發(fā)酵溫度41℃,發(fā)酵時間72 h,3個試驗組發(fā)酵液酸度的平均值可以達到68.67°T,與理論預測值69.21°T的相對誤差為0.79%,與試驗結果相符。

圖5 發(fā)酵溫度、接種量和發(fā)酵起始pH交互作用對發(fā)酵液酸度影響的響應面與等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation temperature,inoculum and fermentation initial pH on the acidity of fermentation broth

3 結論

本研究以青稞酶解液為原料,采用響應面法對益生菌發(fā)酵青稞飲料的工藝條件進行了優(yōu)化,結果表明,3個因素對產(chǎn)酸的影響順序為發(fā)酵起始pH值＞發(fā)酵溫度＞接種量；3個因素兩兩間的交互作用對產(chǎn)酸的影響分別是:發(fā)酵溫度與發(fā)酵起始pH值極顯著(P＜0.01),發(fā)酵溫度與接種量顯著(P＜0.05),發(fā)酵起始pH與接種量不顯著(P＞0.05)。益生菌發(fā)酵青稞飲料的最佳工藝條件為:發(fā)酵起始pH值7.3,直投式益生菌發(fā)酵劑(保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌)接種量4.7%,發(fā)酵溫度41℃,發(fā)酵時間72 h,發(fā)酵液的酸度可達到68.67°T。發(fā)酵液經(jīng)加入蔗糖和復配穩(wěn)定劑調制后,得到顏色呈乳白色,性狀穩(wěn)定,口感宜人,且含有活菌的益生菌發(fā)酵青稞飲料,是一款營養(yǎng)豐富、品質優(yōu)良的保健飲料。

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