張 帥,馬秀靈,李 恒,4,陳 功,4,楊國(guó)華,李潔芝,李 峰,黃 靜,張其圣,4*,游敬剛,陳相杰

(1.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院,四川 溫江 611130；2.成都中醫(yī)藥大學(xué),四川 溫江 611137；3.四川省丹丹郫縣豆瓣集團(tuán)股份有限公司,四川 成都 611732；4.四川東坡中國(guó)泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院,四川 眉山 620000)

黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉在生長(zhǎng)過(guò)程中的一類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物[1-2],已被世界衛(wèi)生組織列為最強(qiáng)化學(xué)致癌物質(zhì)之一[3-4]。目前,已分離鑒別出的黃曲霉毒素共有20多種,其中黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)是毒性最強(qiáng)且致癌性最大的一種。近年來(lái),隨著我國(guó)食品行業(yè)的不斷創(chuàng)新與發(fā)展,豆瓣產(chǎn)業(yè)也隨之呈現(xiàn)穩(wěn)固上升的趨勢(shì),然而開(kāi)放式的豆瓣制作環(huán)境[5-6]和復(fù)雜繁長(zhǎng)的制作工序也使得豆瓣在生產(chǎn)加工過(guò)程中存在某些食品安全隱患。過(guò)去的研究表明,AFB1是豆瓣加工過(guò)程中最主要的問(wèn)題之一。

由于豆瓣生產(chǎn)中所用米曲霉與黃曲霉的生長(zhǎng)條件相近,生產(chǎn)控制不嚴(yán)很容易造成雜菌污染并產(chǎn)生黃曲霉毒素[7]。同時(shí),還有很多關(guān)于豆瓣加工過(guò)程中黃曲霉毒素污染的原因及其控制的研究[8]。在制曲過(guò)程中,徐坤等[7]利用響應(yīng)面法優(yōu)化得到豆瓣的最佳制曲工藝,并控制了豆瓣醬中AFB1的含量。在辣椒醅發(fā)酵過(guò)程中,徐洲等[9]通過(guò)對(duì)辣椒原料中AFB1含量的測(cè)定及防控措施進(jìn)行了探討,得出辣椒醅是導(dǎo)致豆瓣產(chǎn)生AFB1的原因及辣椒醅中優(yōu)勢(shì)菌群為乳酸菌的結(jié)論。徐進(jìn)等[10]利用乳酸菌能影響黃曲霉的生長(zhǎng)及產(chǎn)毒,使得生物學(xué)脫毒法在降低豆瓣中AFB1的含量方面得到了應(yīng)用。在豆瓣發(fā)酵過(guò)程中,汪先丁等[11]研究了郫縣豆瓣在自然發(fā)酵過(guò)程中真菌群落的演替與黃曲霉毒素B1消長(zhǎng)的關(guān)系。此外,關(guān)統(tǒng)偉等[12]探討了郫縣豆瓣在不同發(fā)酵期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)的演替,趙紅宇等[13-14]對(duì)豆瓣后發(fā)酵期細(xì)菌多樣性和真菌演替變化的研究,劉春鳳等[15]對(duì)成熟期豆瓣醬醅中的微生物群落分析都為豆瓣發(fā)酵過(guò)程中AFB1消長(zhǎng)的原因提供了依據(jù)。然而,國(guó)內(nèi)外基于生產(chǎn)過(guò)程來(lái)系統(tǒng)研究發(fā)酵過(guò)程中黃曲霉毒素B1的變化還少有報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)基于郫縣豆瓣的加工過(guò)程,對(duì)其各個(gè)關(guān)鍵工藝點(diǎn)進(jìn)行AFB1的測(cè)定,同時(shí)按照豆瓣的制作工藝,在實(shí)驗(yàn)室模擬工廠(chǎng)的生產(chǎn)流程制作豆瓣,并進(jìn)行AFB1含量的測(cè)定,以期為豆瓣制作過(guò)程中控制黃曲霉毒素的產(chǎn)生和建立關(guān)鍵控制點(diǎn)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

制曲期、辣椒醅發(fā)酵期、豆瓣成熟期和后熟期各時(shí)間段樣本:采集于郫縣丹丹豆瓣廠(chǎng)；甲醇(分析純):成都市科龍化工試劑廠(chǎng)；黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)試劑盒:北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ST-360酶標(biāo)儀:上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司；TDL-40B低速臺(tái)式離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；THZ-C-1全溫振蕩器:蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 郫縣豆瓣生產(chǎn)工藝流程及操作要點(diǎn)

(1)干蠶豆瓣在沸水中漂燙3～5 min后冷卻至室溫,加入25%的面粉和0.05%的曲種拌勻(以混合干料計(jì))；30℃條件下制曲48h,32%鹽水拌曲,保溫發(fā)酵6～8月得到甜瓣子。

(2)新鮮辣椒剁碎,加15%鹽水鹽漬,發(fā)酵6個(gè)月得到辣椒醅。

(3)65%辣椒醅和35%甜瓣子配兌混合(g∶g),適當(dāng)補(bǔ)鹽,通過(guò)“翻、曬、露”6個(gè)月得到成熟郫縣豆瓣。

1.3.2 AFB1測(cè)定方法

按照GB 5009.22—2016《食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定》方法進(jìn)行測(cè)定[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 制曲過(guò)程中AFB1含量的變化

制曲作為豆瓣加工過(guò)程中的首要環(huán)節(jié),探究該階段AFB1的變化對(duì)于控制其在豆瓣中的含量十分重要。通過(guò)隨機(jī)選取豆瓣廠(chǎng)中兩個(gè)制曲曲房,從制曲起到制曲結(jié)束共48 h進(jìn)行動(dòng)態(tài)跟蹤取樣,每次兩個(gè)平行,得到AFB1在該階段的含量及變化趨勢(shì)。測(cè)定結(jié)果如圖1所示。

圖1 制曲過(guò)程中黃曲霉毒素B1含量的變化Fig.1 Change of aflatoxin B1content during koji making

由圖1可知,制曲過(guò)程中AFB1含量總體偏低,保持在0～0.25 μg/kg范圍內(nèi),這與汪先丁等[11]所報(bào)道自然發(fā)酵條件下豆瓣醬制曲階段的AFB1含量為2.097 μg/kg存在差異,其原因或與近年來(lái)大多豆瓣廠(chǎng)改用純種發(fā)酵有關(guān)。同時(shí),AFB1含量在制曲前期最少,表現(xiàn)在制曲時(shí)間為0～40 h時(shí)AFB1基本無(wú)法檢出；在40 h后至出曲階段AFB1的含量有所升高,但整體幅度不大。因此可認(rèn)為制曲階段對(duì)于豆瓣中AFB1含量的影響不大,不是郫縣豆瓣加工過(guò)程中形成AFB1的關(guān)鍵控制點(diǎn)。

2.2 甜瓣子發(fā)酵過(guò)程中AFB1含量的變化

通過(guò)記錄工廠(chǎng)內(nèi)所有曲池里甜瓣子的發(fā)酵時(shí)間,再以發(fā)酵時(shí)間由短至長(zhǎng)進(jìn)行排序,每個(gè)時(shí)間段選出至少兩個(gè)曲池進(jìn)行取樣,以探求甜瓣子發(fā)酵對(duì)豆瓣加工過(guò)程中AFB1含量變化的影響,測(cè)定結(jié)果如圖2所示。

圖2 甜瓣子發(fā)酵不同時(shí)期黃曲霉毒素B1含量的變化Fig.2 Change of aflatoxin B1content during different periods of sweet bean fermentation

由圖2可知,在發(fā)酵1～8個(gè)月內(nèi)甜瓣子的AFB1含量呈明顯上升趨勢(shì),即從發(fā)酵1個(gè)月時(shí)的0.18 μg/kg增加至發(fā)酵8個(gè)月時(shí)的1.09 μg/kg。同時(shí),圖2中各時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的AFB1值未呈現(xiàn)線(xiàn)性變化的原因可能是由于本試驗(yàn)的取樣并不是基于動(dòng)態(tài)跟蹤,而是根據(jù)生產(chǎn)線(xiàn)的實(shí)際情況來(lái)選取的,但試驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)一定的規(guī)律性則表明工廠(chǎng)加工豆瓣醬的工藝是較為穩(wěn)定的,且造成甜瓣子在發(fā)酵過(guò)程中AFB1含量上升的原因比較固定。綜上可知甜瓣子的發(fā)酵時(shí)間是郫縣豆瓣加工過(guò)程中形成AFB1的關(guān)鍵控制點(diǎn)之一。

2.3 辣椒醅發(fā)酵過(guò)程中AFB1含量的變化

由于受豆瓣加工工藝的限制,對(duì)辣椒醅發(fā)酵過(guò)程中AFB1含量變化只能通過(guò)剛剁碎的辣椒與發(fā)酵成熟的辣椒醅(6個(gè)月)來(lái)進(jìn)行研究。樣品測(cè)定結(jié)果如圖3所示。

圖3 辣椒醅發(fā)酵不同時(shí)期黃曲霉毒素B1含量的變化Fig.3 Change of aflatoxin B1content during different periods of pepper grains fermentation

由圖3可知,辣椒醅在發(fā)酵0月到6月的AFB1含量有所降低,從1.25μg/kg減至0.80μg/kg。由于大部分的AFB1是由黃曲霉代謝產(chǎn)生的,表明在辣椒醅發(fā)酵過(guò)程中黃曲霉的生長(zhǎng)受到部分抑制,因此適當(dāng)延長(zhǎng)辣椒醅的發(fā)酵時(shí)間有助于減少豆瓣中的AFB1含量。同時(shí)也可推知在辣椒醅發(fā)酵階段的AFB1污染主要來(lái)源于原料。表明辣醅發(fā)酵時(shí)間和辣椒原料是控制郫縣豆瓣中AFB1含量的關(guān)鍵點(diǎn)。

2.4 豆瓣后熟期AFB1含量的變化

在豆瓣發(fā)酵后熟期,通過(guò)選取發(fā)酵時(shí)間為1、2、3、4、5和6個(gè)月時(shí)間段的豆瓣醬,來(lái)研究不同豆瓣醬發(fā)酵時(shí)間對(duì)其AFB1含量的影響。每個(gè)時(shí)間段取兩個(gè)曲池樣本,測(cè)定結(jié)果如圖4所示。

圖4 豆瓣醬后熟期黃曲霉毒素B1含量的變化Fig.4 Change of aflatoxin B1content during post-ripening period of bean paste

由圖4可知,豆瓣醬AFB1含量在其發(fā)酵過(guò)程中呈動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì),總體含量為0.90～2.63 μg/kg,低于國(guó)家對(duì)發(fā)酵調(diào)味品的最新限量標(biāo)準(zhǔn)(5 μg/kg)[17]。在發(fā)酵時(shí)間為1～3月時(shí),豆瓣醬中AFB1含量呈上升趨勢(shì)；3～6月時(shí),AFB1含量有所下降,且在發(fā)酵4個(gè)月后保持穩(wěn)定。表明豆瓣醬在發(fā)酵一定的年份后,其AFB1含量整體趨于穩(wěn)定且總體低于國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn),但該階段與成熟甜瓣子和辣椒醅中的AFB1含量相比,其AFB1含量上升明顯,究其原因可能是由于豆瓣醬加工工藝中的“翻、曬、露”過(guò)程導(dǎo)致空氣中雜菌混入豆瓣醬的發(fā)酵過(guò)程中。因此豆瓣醬的發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵環(huán)境是控制郫縣豆瓣中AFB1含量的關(guān)鍵點(diǎn)。

2.5 豆瓣加工過(guò)程中的關(guān)鍵控制點(diǎn)研究

為了進(jìn)一步明確豆瓣加工過(guò)程中影響AFB1含量的關(guān)鍵點(diǎn),在實(shí)驗(yàn)室模擬工廠(chǎng)的豆瓣加工工藝,并依次選取豆瓣制作過(guò)程中的成曲、成熟甜瓣子(該階段發(fā)酵6個(gè)月)、成熟辣椒醅(該階段發(fā)酵6個(gè)月)和成品豆瓣醬(該階段發(fā)酵3個(gè)月)四個(gè)不同階段的樣本進(jìn)行AFB1含量測(cè)定,旨在探究整個(gè)豆瓣醬制作過(guò)程中控制AFB1含量的主要環(huán)節(jié)。

圖5 豆瓣醬發(fā)酵過(guò)程中黃曲霉毒素B1含量的變化Fig.5 Change of aflatoxin B1content during different periods of bean paste

由圖5可知,在實(shí)驗(yàn)室擬制作的豆瓣制曲階段AFB1含量較豆瓣其他加工過(guò)程的含量低,表明原料中蠶豆與面粉不是豆瓣醬中AFB1產(chǎn)生的主要因素；在制曲后期積累AFB1,可能是由于第二次翻曲后與空氣中雜菌接觸,導(dǎo)致污染并產(chǎn)生AFB1。在甜瓣子發(fā)酵階段,AFB1含量較制曲階段略微上升。由于甜瓣子是采用保溫密封發(fā)酵,一般不會(huì)與外界環(huán)境接觸,因此在其發(fā)酵期受雜菌污染的機(jī)率較低,AFB1的積累可能是由于制曲階段的雜菌引入所致。辣椒醅在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中其AFB1變化呈平穩(wěn)上升趨勢(shì),受AFB1污染的主要原因可能部分是由原料的帶入,但由于AFB1含量整體較低,結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)可知這與辣椒醅中的優(yōu)勢(shì)菌群乳酸菌對(duì)AFB1具有分解作用有關(guān)[18]。在混合發(fā)酵至成品后,豆瓣醬中AFB1含量顯著上升,原因可能是由于成熟辣椒醅和甜瓣子的引入,也可能由于豆瓣醬后熟期是需要每日進(jìn)行翻曬的,相較于甜瓣子與辣椒醅的密封發(fā)酵,該階段與空氣接觸的機(jī)會(huì)更多,因此就更容易被空氣中的雜菌污染。綜上所述,可以看出豆瓣醬的“翻曬露”階段導(dǎo)致豆瓣醬中AFB1的含量大幅增加。

3 結(jié)論

本研究基于加工傳統(tǒng)郫縣豆瓣的各關(guān)鍵工藝流程,包括制曲階段,甜瓣子發(fā)酵階段,辣椒醅發(fā)酵階段和豆瓣醬后熟階段,在實(shí)驗(yàn)室對(duì)豆瓣醬進(jìn)行擬制作,以此研究各工藝點(diǎn)的AFB1含量變化情況并得到關(guān)鍵控制點(diǎn)。結(jié)果表明,豆瓣加工過(guò)程中AFB1始終低于發(fā)酵調(diào)味品的國(guó)家最新限量標(biāo)準(zhǔn)(5 μg/kg),且含量隨著豆瓣醬的成熟總體保持上升趨勢(shì)。雖然在制曲環(huán)節(jié)時(shí)AFB1含量最低,但從甜瓣子發(fā)酵階段可以看出,制曲階段AFB1的累積效應(yīng)是非常明顯的,所以應(yīng)該繼續(xù)采用人工制曲,并且應(yīng)該在制曲環(huán)節(jié)嚴(yán)加控制,防止AFB1從制曲階段開(kāi)始累積。同時(shí),從辣椒醅的AFB1含量變化可以看出造成辣椒醅中AFB1污染的主要原因是原料引入,所以應(yīng)對(duì)原料辣椒醅的來(lái)源和其儲(chǔ)存環(huán)境嚴(yán)加把關(guān),并對(duì)變質(zhì)的辣椒及時(shí)清除。此外,在豆瓣醬發(fā)酵過(guò)程中,AFB1含量與其他加工環(huán)節(jié)相比呈現(xiàn)大幅上升趨勢(shì),表明在“翻曬露”環(huán)節(jié)的豆瓣醬后熟期是影響AFB1產(chǎn)生的關(guān)鍵階段。而且由于這個(gè)階段翻曬頻繁(每日一次),導(dǎo)致豆瓣醬與空氣接觸更多從而使得其易被雜菌污染,所以豆瓣“翻曬露”階段的環(huán)境條件十分關(guān)鍵。雖然豆瓣醬中AFB1的總體含量低于國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn),但為了使人們盡量避免受到食品中諸如黃曲霉毒素B1等真菌毒素的威脅,應(yīng)著力改善相關(guān)的生產(chǎn)環(huán)境,特別應(yīng)加強(qiáng)在生產(chǎn)環(huán)境中對(duì)空氣中雜菌的隔離,以此使得我國(guó)傳統(tǒng)食品的安全問(wèn)題真正得到有效改善。

[1]宮春波,姜連芳,張永翠,等.黃曲霉毒素在食品中的危害及去除方法[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2004,25(1):120-123.

[2]吳兆蕃.黃曲霉毒素的研究進(jìn)展[J].甘肅科技,2010,25(18):89-93.

[3]勞文艷,林素珍.黃曲霉毒素對(duì)食品的污染及危害[J].北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào),2011,25(1):64-69.

[4]靳學(xué)敏.郫縣豆瓣中黃曲霉毒素B1在線(xiàn)監(jiān)測(cè)技術(shù)[D].成都:西華大學(xué),2011.

[5]徐 丹.釀造醬油中黃曲霉毒素B1的產(chǎn)生及其控制研究[D].無(wú)錫:江南大學(xué),2012.

[6]王曉偉,高鵬飛,姚國(guó)強(qiáng).乳酸菌對(duì)乳制品中黃曲霉毒素的生物防治作用[J].中國(guó)乳品工業(yè),2015,43(3):42-49.

[7]徐 坤,王 濤.響應(yīng)面法優(yōu)化混合發(fā)酵法控制郫縣豆瓣中黃曲霉毒素B1含量的最佳制曲條件研究[J].中國(guó)釀造,2009,28(11):28-31.

[8]靳學(xué)敏,車(chē)振明.淺談豆瓣生產(chǎn)過(guò)程中的安全控制[J].中國(guó)食品工業(yè),2010(1):62-63.

[9]徐 洲,譚書(shū)明,焦彥朝.酶聯(lián)免疫法測(cè)定干辣椒中的黃曲霉毒素B1[J].食品科學(xué),2009,30(10):245-247.

[10]徐 進(jìn),李玉偉,計(jì) 融.乳桿菌及不同pH值對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)與產(chǎn)毒的影響[J].中國(guó)食品衛(wèi)生,2001,13(6):1-6.

[11]汪先丁,劉 敏,高 鵬,等.郫縣豆瓣自然發(fā)酵過(guò)程中真菌菌落的演替及黃曲霉毒素B1的消長(zhǎng)[J].食品科學(xué),2012,33(11):142-146.

[12]關(guān)統(tǒng)偉,向慧平,王鵬昊,等.基于高通量測(cè)序的郫縣豆瓣不同發(fā)酵期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)演替[J].食品科學(xué),2017,38(4):1-12.

[13]趙紅宇,徐煒楨,楊國(guó)華,等.基于高通量測(cè)序的郫縣豆瓣后發(fā)酵期細(xì)菌多樣性研究[J].食品科學(xué),2017,38(10):117-122.

[14]趙紅宇,徐煒楨,楊國(guó)華,等.基于高通量測(cè)序的郫縣豆瓣后發(fā)酵期真菌演替變化研究[J].食品科學(xué),2017,38(16):51-56.

[15]劉春鳳,劉金霞,蔣立勝,等.傳統(tǒng)發(fā)酵成熟期醬醅中的微生物群落分析[J].食品工業(yè)科技,2012,33(13):122-126.

[16]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB/T 5009.22—2016食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2016.

[17]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB/T 2761—2017食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2017.

[18]劉永琪.豆瓣醬發(fā)酵的研究[D].廣州:華南理工大學(xué),2014.