孟 君,滕 暉,張 凱,唐 雪,李曉娟*

(1.株洲千金藥業(yè)股份有限公司,湖南 株洲 412000；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫 214122)

諾麗(Morinda citrifoliaL.)又名海巴戟天、海巴戟,是南太平洋島國及其他熱帶、亞熱帶地區(qū)生長的小型灌木或喬木,已有2 000多年的歷史[1-2],在我國海南、西沙、臺(tái)灣亦有種植。諾麗果富含多種必需氨基酸、維生素、微量元素、多糖等營養(yǎng)成分[3]以及酚類、黃酮類等植物活性物質(zhì)[4],具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗炎癥、緩解疼痛、提高免疫力等功效[5]。研究表明,諾麗果汁含有豐富的多糖類、三萜類、環(huán)烯醚萜類及抗氧化物質(zhì),能激活細(xì)胞免疫系統(tǒng)(包括NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞),刺激胸腺發(fā)育[6],促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的釋放以增強(qiáng)免疫力[7],對(duì)多種疾病有預(yù)防和治療作用。諾麗作為一種新興保健食材,在西方社會(huì)的普及程度日益提高[8]。2010年,諾麗果漿已獲批為我國新食品原料,對(duì)于諾麗果的加工和利用也在不斷的改進(jìn)和創(chuàng)新。

諾麗酒是以諾麗果汁為原料,結(jié)合現(xiàn)代新工藝自主研究制作的一款果酒,并依據(jù)傳統(tǒng)中藥組方加入枸杞、龍眼、黃精、紅棗、人參等中藥成分,具有補(bǔ)益心脾、養(yǎng)血安神、健脾潤肺、補(bǔ)氣養(yǎng)陰等功效。本研究分別從細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞活性和血清細(xì)胞因子水平5個(gè)方面評(píng)價(jià)了諾麗酒的免疫增強(qiáng)作用,以期為諾麗酒的保健研究和開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

諾麗酒(酒精度為9%vol):株洲千金藥業(yè)股份有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基:南京建成生物工程研究所；刀豆蛋白A(concanavalinA,ConA)、沒食子酸(純度≥98%):美國Sigma公司；印度墨汁:北京索萊寶科技有限公司；綿羊紅細(xì)胞、豚鼠血清:南京森貝伽生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞因子測定試劑盒:廈門慧嘉生物科技有限公司；蘆丁(純度≥98%):上海哈靈生物科技有限公司；Hank's液、胎牛血清:美國Gibco公司；YAC-1細(xì)胞:北京北納科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BioTek Epoch全波長酶標(biāo)儀:美國Biotek公司；5804R離心機(jī):德國Eppendorf公司；BBD6220細(xì)胞培養(yǎng)箱:美國ThermoFisher公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀:美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 釀造工藝流程

1.3.2 動(dòng)物與分組

240只C57BL/6J小鼠(4周齡,(12.09±0.27)g):上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,飼喂于江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。采用12/12 h光照周期(8∶00-20∶00),恒溫(23±2)℃,恒濕(60±5)%條件,所有實(shí)驗(yàn)操作均按照江南大學(xué)動(dòng)物使用和福利協(xié)會(huì)要求進(jìn)行。

預(yù)飼1周后,小鼠隨機(jī)分為:①空白組(CON,10只),灌胃生理鹽水0.2 mL；②酒基對(duì)照組(CON-WB,10只),灌胃含9%乙醇生理鹽水0.2mL；③蜂膠組(陽性對(duì)照,CON-PRO,10只),灌胃含10%蜂膠的溶液0.2 mL；④低/中/高劑量諾麗酒組(L-NONI/M-NONI/H-NONI,每組10只),灌胃10mL/kg體質(zhì)量、20mL/kg體質(zhì)量、40mL/kg體質(zhì)量諾麗酒。整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期為45 d,所有動(dòng)物每天相同時(shí)間點(diǎn)灌胃1次,自由進(jìn)食、飲水。

1.3.3 分析檢測方法

蛋白質(zhì)含量測定:采用GB5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》凱氏定氮法；粗脂肪含量測定:采用GB/T 5009.6—2016《食品中粗脂肪的測定》索氏抽提法；總糖與還原糖含量測定:采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》斐林試劑滴定法；總多酚(以沒食子酸計(jì)):Folin-Ciocaleu法[9]；總黃酮:分光光度法[10]；增強(qiáng)免疫功能測定:參照衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2013版)中增強(qiáng)免疫力功能檢驗(yàn)方法。

1.3.4 小鼠體質(zhì)量及臟器指數(shù)

最后一次給藥后禁食12 h,稱體質(zhì)量后脫臼處死,取脾臟、胸腺,去盡筋膜,用濾紙吸干表面血污,稱質(zhì)量,臟器指數(shù)計(jì)算公式如下:

1.3.5 細(xì)胞免疫功能測定

小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)采用四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法[11]:取6孔板,孔板上放置200目細(xì)胞篩,加入4 mL Hank's液,無菌取小鼠脾臟后置于細(xì)胞篩上,用注射器內(nèi)芯磨碎,制成單細(xì)胞懸液,再用Hank's液洗滌兩次。將細(xì)胞懸浮于2 mL完全培養(yǎng)基中,計(jì)數(shù),調(diào)整濃度為3×106個(gè)/mL。取懸液1 mL于6孔板中(兩孔),一孔加入100 μg/mL ConA75 μL,另一孔作為對(duì)照孔。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h,吸去上清0.7 mL,加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,同時(shí)加入MTT 50 μL/孔,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后,毎孔加入1 mL酸性異丙醇,吹打使紫色結(jié)晶完全溶解,分裝到96孔板中,于波長570 nm處測吸光度值。以加入ConA孔的光密度減去不加ConA孔的光密度值代表淋巴細(xì)胞的增值能力。脾淋巴細(xì)胞增值能力計(jì)算公式如下:

二硝基氟苯誘導(dǎo)的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)采用耳腫脹法[11]:取二硝基氟苯50 mg與5 mL丙酮麻油溶液(丙酮∶麻油=1∶1)混勻。小鼠腹部用8%硫化鈉溶液脫毛后,用50 μL二硝基氟苯溶液均勻涂抹。5 d后,用二硝基氟苯溶液10 μL均勻涂抹于小鼠一側(cè)耳朵。24 h后,用打孔器取下耳片,稱質(zhì)量,耳片質(zhì)量差值表示遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)強(qiáng)弱。耳腫脹率計(jì)算公式如下:

1.3.6 體液免疫功能測定

抗體生成細(xì)胞檢測[11]:實(shí)驗(yàn)5 d前小鼠腹腔注射2%綿羊紅細(xì)胞0.2 mL。取0.5 g瓊脂糖加入100 mL生理鹽水中,加熱溶解,50℃時(shí)以1 mL/孔加入6孔板中,冷卻凝固后,作為底層培養(yǎng)基。取0.5g瓊脂糖加入100mLHank's液中,加熱溶解,以0.5 mL/管加入試管中50℃保溫,作為頂層培養(yǎng)基。無菌取小鼠脾臟制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整濃度為1×107個(gè)/mL。取脾細(xì)胞懸液200 μL,20%綿羊紅細(xì)胞50 μL加入頂層培養(yǎng)基中,迅速混勻,倒入底層培養(yǎng)基上。培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h,毎孔加入500 μL用培養(yǎng)基稀釋10倍的補(bǔ)體,孵育2 h。結(jié)果以空斑數(shù)/106脾細(xì)胞數(shù)表示。

血清溶血素測定采用半數(shù)溶血值(halfhemolyticvalue,HC50)法:實(shí)驗(yàn)5 d前小鼠腹腔注射2%綿羊紅細(xì)胞0.2 mL。小鼠眼球取血,放置1 h后4 000 r/min離心10 min,收集血清。樣品管:取血清10 μL,用1 mL 5倍稀釋的SA緩沖液(C4H4N2O30.46g,MgCl20.1g,CaCl2·2H2O0.2g,NaCl8.38g,NaHCO30.252 g,C8H11N2NaO30.3 g,加蒸餾水至1 000 mL)稀釋,在離心管中加入100 μL?？瞻坠?加入100 μL 5倍稀釋的SA緩沖液。毎管依次加入10%綿羊紅細(xì)胞50 μL,補(bǔ)體100 μL。37℃保溫30 min,1 500 r/min離心10 min。樣品管與空白管各取50 μL于96孔板中,加入都氏試劑150 μL。半數(shù)溶血空加入10%綿羊紅細(xì)胞12.5 μL,加都氏試劑187.5 μL,放置10 min。在波長540 nm處測吸光度值。半數(shù)溶血值計(jì)算公式如下:

1.3.7 單核-巨噬細(xì)胞功能測定

小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn):小鼠稱體質(zhì)量,按毎10 g體質(zhì)量0.1 mL從尾靜脈注射用生理鹽水稀釋3倍的印度墨汁。注入后2 min、10 min,分別從小鼠內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL,并立即加入到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中。于波長660 nm處測吸光度值。吞噬指數(shù)a計(jì)算公式如下:

式中:OD1為2 min時(shí)的吸光度值；OD2為10 min時(shí)的吸光度值；t1為第一次取血時(shí)間；t2為第二次取血時(shí)間。

小鼠腹腔吞噬熒光微球?qū)嶒?yàn):實(shí)驗(yàn)前5 d給小鼠腹腔注射0.2mL2%綿羊紅細(xì)胞激活小鼠巨噬細(xì)胞。頸椎脫臼處死小鼠,腹腔注射加小牛血清的Hank's液3 mL/只,輕揉3 min,再將腹水吸出,調(diào)整巨噬細(xì)胞濃度為(4～6)×105/mL。取巨噬細(xì)胞1 mL于6孔板中,加入熒光微球(1×107/板),置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2 h,孵育后棄上清,用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌2次。200目篩網(wǎng)過濾后上流式細(xì)胞儀分析。巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球吞噬率計(jì)算公式如下:

1.3.8 NK細(xì)胞活性測定

靶細(xì)胞制備:實(shí)驗(yàn)前24 h將YAC-1細(xì)胞傳代培養(yǎng),用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/mL。效應(yīng)細(xì)胞制備:小鼠無菌取脾并制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整濃度為2×107個(gè)/mL。取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100 μL加入U(xiǎn)形96孔板；靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)基各100 μL；靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和2.5%曲拉通各100 μL。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h,取出后1 500 r/min離心5 min,取上清100 μL置于96孔板中,同時(shí)加入乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)基質(zhì)液100 μL,靜置3 min,毎孔加1 mol/L HCl 30 μL,波長490 nm處測吸光度值。NK細(xì)胞活性計(jì)算公式如下:

1.3.9 細(xì)胞因子測定

小鼠采用摘除眼球方法取血,分離血清,按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒說明書操作,測定小鼠血清中白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6、IL-10以及腫瘤壞死因子(tumournecrosisfactor,TNF)-α含量。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 23分析處理,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 諾麗酒主要營養(yǎng)成分

由表1可知,諾麗酒中蛋白質(zhì)含量為(0.25±0.02)g/100mL,粗脂肪含量為(0.97±0.01)g/100 mL,總糖和還原糖含量分別為(6.21±0.09)g/100 mL和(5.49±0.10)g/100 mL。諾麗酒的總多酚和總黃酮含量豐富,分別為(553.60±0.82)μg/mL與(230.56±1.68)μg/mL,具有降脂、抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等多種功效[12]。

表1 諾麗酒的營養(yǎng)成分及活性物質(zhì)分析Table 1 Analysis of nutritional components and active substances of Noni wine

2.2 小鼠體質(zhì)量及臟器指數(shù)

脾臟和胸腺是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)重要的免疫器官,是免疫細(xì)胞產(chǎn)生、分化、成熟、增值的主要場所。免疫器官的質(zhì)量是反應(yīng)機(jī)體非特異性免疫的重要指標(biāo)[13]。由表2可知,連續(xù)灌胃45 d后,三個(gè)劑量諾麗酒組與CON-WB組相比均無顯著性差異(P＞0.05),表明諾麗酒對(duì)小鼠體質(zhì)量和免疫臟器指數(shù)無明顯影響。

表2 小鼠體質(zhì)量及臟器指數(shù)Table 2 Body mass and visceral indexes of mice

2.3 細(xì)胞免疫功能

表3 小鼠細(xì)胞免疫功能Table 3 Cellular immune function of mice

當(dāng)T淋巴細(xì)胞受到ConA刺激后發(fā)生母細(xì)胞增值反應(yīng),分化成為效應(yīng)T細(xì)胞,具有細(xì)胞免疫的功能[14]；遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)是由致敏性T細(xì)胞與相應(yīng)的抗原結(jié)合,引起單核細(xì)胞浸潤和細(xì)胞變性壞死的局部變態(tài)反應(yīng)炎癥,炎癥反應(yīng)的強(qiáng)弱可以反應(yīng)細(xì)胞免疫能力的高低[15]。由表3可知,與CON-WB組相比,中、高劑量諾麗酒可顯著提高小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力(P＜0.05),但對(duì)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)沒有效果。PALU A K等[16]研究表明,諾麗果中的寡糖成分對(duì)正常小鼠脾淋巴有明顯的促進(jìn)增殖作用,并能增加脾細(xì)胞產(chǎn)生抗體數(shù)目,提高小鼠免疫力。結(jié)果表明,諾麗酒提高小鼠細(xì)胞免疫功能的作用可能與其保留了諾麗果中的有效功能成分有關(guān)。

2.4 體液免疫功能

綿羊紅細(xì)胞與經(jīng)過綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞懸液混合后,脾細(xì)胞分泌的抗體可使其周圍的綿羊紅細(xì)胞發(fā)生溶解,形成肉眼可見的空斑。經(jīng)過免疫的小鼠血清中含有抗綿羊紅細(xì)胞的抗體,可以溶解綿羊紅細(xì)胞,釋放血紅蛋白,通過測定血紅蛋白含量可以反應(yīng)動(dòng)物抗體產(chǎn)生量[17]。由表4可知,三個(gè)劑量諾麗酒對(duì)溶血空斑和HC50值均無顯著性影響(P＞0.05),表明諾麗酒不具有增強(qiáng)體液免疫功能作用。

表4 小鼠體液免疫功能Table 4 Humoral immune function of mice

2.5 單核-巨噬細(xì)胞功能

巨噬細(xì)胞具有吞噬異物的非特異性免疫功能,在體內(nèi)參與免疫防御,能有效清除病原體,當(dāng)異物入侵機(jī)體后,即可被巨噬細(xì)胞迅速吞噬,因此,巨噬細(xì)胞的吞噬能力是反應(yīng)機(jī)體非特異性免疫的一項(xiàng)重要指標(biāo)[18]。SASMITO E等[19]的研究表明,諾麗果汁中豐富的多糖類物質(zhì)可顯著提高巨噬細(xì)胞吞噬功能。由表5可知,與CON-WB組相比,中、高劑量諾麗酒可顯著提高碳廓清吞噬指數(shù)和巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球吞噬率(P＜0.05),表明諾麗酒具有增強(qiáng)單核-巨噬細(xì)胞活性功能。

表5 小鼠單核-巨噬細(xì)胞活性Table 5 Monocyte-macrophage activity of mice

2.6 NK細(xì)胞活性

NK細(xì)胞是一種沒有T和B細(xì)胞表面標(biāo)志的淋巴細(xì)胞,具有非特異性殺傷功能,具有抗腫瘤、抗感染等作用,是機(jī)體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞。崔英等[20]研究表明,植物多酚具有較強(qiáng)的抗氧化和免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)作用。FURUSAWA E等[21]研究表明,諾麗果汁中的多糖類物質(zhì)可明顯提高小鼠體內(nèi)NK殺傷能力。由表6可知,中、高劑量諾麗酒可顯著提高小鼠NK細(xì)胞活性(P＜0.05),表明諾麗酒中含有的多酚及多糖物質(zhì)可能是提高NK細(xì)胞活性的主要活性物質(zhì)。

表6 小鼠NK細(xì)胞活性Table 6 NK cell activity of mice

2.7 細(xì)胞因子含量

巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫的重要成員,具有殺傷、吞噬、分泌活性物質(zhì)、遞呈抗原、調(diào)控機(jī)體免疫以及抑制腫瘤等多種活性,活化后的巨噬細(xì)胞能分泌近百種與免疫應(yīng)答及炎癥密切相關(guān)的活性物質(zhì)[22]。由表7可知,諾麗酒對(duì)IL-1的分泌無顯著性影響(P＞0.05),但可顯著提高IL-6、IL-10和TNF-α分泌(P＜0.05)。IL-6能活化T細(xì)胞并產(chǎn)生淋巴因子,能使B細(xì)胞前體成為產(chǎn)生抗體的細(xì)胞,增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的裂解功能；IL-10為一種細(xì)胞因子合成抑制劑和巨噬細(xì)胞失活劑,抑制內(nèi)毒素入侵引起的促炎癥因子釋放,同時(shí)還能促進(jìn)B細(xì)胞增殖和抗體產(chǎn)生[23]；TNF-α可殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞,提高中性粒細(xì)胞的吞噬能力[8]。SUN W J等[24]的研究表明,多糖是諾麗果中的重要活性成分,能夠激發(fā)IL-1、IL-10、TNF-α、TFN-γ等炎癥細(xì)胞因子的釋放,促使機(jī)體的免疫系統(tǒng)能力提升,表明諾麗酒的免疫調(diào)節(jié)作用與影響細(xì)胞因子水平有關(guān)。

表7 小鼠血清細(xì)胞因子水平Table 7 Serum cytokine levels of mice

3 結(jié)論

以10 mL/kg體質(zhì)量、20 mL/kg體質(zhì)量、40 mL/kg體質(zhì)量劑量的諾麗酒灌胃小鼠45 d,結(jié)果表明,各劑量組對(duì)小鼠體質(zhì)量、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)無顯著性影響(P＞0.05)。20 mL/kg體質(zhì)量和40 mL/kg體質(zhì)量劑量諾麗酒組的脾淋巴細(xì)胞增值能力、巨噬細(xì)胞吞噬活力及NK細(xì)胞活性均顯著高于空白對(duì)照組與酒基對(duì)照組,并且血漿中IL-6、IL-10與TNF-α含量也顯著高于空白對(duì)照組與酒基對(duì)照組,表明中高劑量的諾麗酒可以促進(jìn)小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子的釋放,從而提高小鼠體內(nèi)免疫應(yīng)答能力,增強(qiáng)機(jī)體免疫力。

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