李俊杰,管軼男,管 斌*,孔 青

(1.中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島 266003；2.青島蔚藍(lán)生物股份有限公司,山東 青島 266101)

硒是人體必需的微量元素之一,對機體至關(guān)重要。其保護機體免受自由基的損傷,參與重金屬解毒,調(diào)控機體免疫系統(tǒng)[1],是生物體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧還蛋白還原酶、碘化甲腺原氨酸脫碘酶等多種蛋白的重要組成部分[2]。機體可以攝入無機硒和有機硒進行補硒,其中有機硒化合物生物利用率高,毒性較小。酵母在培養(yǎng)過程中可以通過自身的代謝活動,將無機硒與體內(nèi)大分子結(jié)合轉(zhuǎn)化為有機形式,主要以硒代氨基酸和含硒蛋白形式存在[3]。富硒酵母由于富含蛋白質(zhì)和B族維生素、食用安全性強以及生物利用率高等優(yōu)點而成為缺硒人群的膳食補充劑[4]。酵母對硒的富集受菌種、培養(yǎng)基的成分及硒濃度的影響[2]。目前常用的富硒酵母菌株有:釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)[4-6]。C.utilis可以在胞內(nèi)大量積累谷胱甘肽(glutathione,GSH),作為美國食品藥品監(jiān)督管理局評價食品添加劑安全性指標(biāo)(generally regarded as safe,GRAS)微生物,應(yīng)用前景廣闊[7]。高生物量是酵母富硒研究的基礎(chǔ),但目前,常用的培養(yǎng)基加硒后酵母生長會受到明顯的抑制,不利于無機硒的生物轉(zhuǎn)化。常見培養(yǎng)基的優(yōu)化多集中在釀酒酵母上,對C.utilis培養(yǎng)基優(yōu)化的研究較少[8-9]。因此本試驗從富含GSH的C.utilis菌株出發(fā),運用Plackett-Burman設(shè)計和響應(yīng)面法對培養(yǎng)基組成進行優(yōu)化,以期為提高菌株性能,實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)2.0281:中科院微生物保藏中心,按照參考文獻[10]的方法高效選育得到菌株U-16。

1.1.2 試劑

葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、變色酸、鹽酸苯肼、氯酸鉀(分析純或生化試試):國藥集團化學(xué)試劑有限公司；谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%):美國Sigma公司；庚烷磺酸鈉、甲醇(均為色譜純):百靈威科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose,YPD)(種子培養(yǎng)基):葡萄糖2%,蛋白胨2%,酵母粉1%。斜面培養(yǎng)基:在種子培養(yǎng)基中加入2%瓊脂。

酵母浸出粉胨蔗糖(yeast extract peptone sucrose,YPS)培養(yǎng)基:蔗糖5%,蛋白胨2%,酵母粉1%。

普通培養(yǎng)基:按照參考文獻[11]配制。

G培養(yǎng)基:按照參考文獻[12]配制。

G改良培養(yǎng)基:葡萄糖30 g/L,蛋白胨10 g/L,(NH4)2SO46 g/L,KH2PO43 g/L,肌醇 3 mg/L,MgSO42.4 g/L,FeSO4·7H2O0.01g/L,ZnSO4·7H2O0.12g/L,MnSO4·6H2O 0.024g/L,CuSO4·5H2O0.006g/L,維生素B61.2mg/L,生物素0.06mg/L。

S培養(yǎng)基:按照參考文獻[9]配制。

以上培養(yǎng)基pH均為6.0,發(fā)酵12 h加入亞硒酸鈉(濾膜過濾除菌)[11]。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography,HPLC):上海荊和分析儀器有限公司；TGL-16C離心機:上海安亭科學(xué)儀器廠；722N型可見分光光度計:上海精科電子有限公司；HZQ-X100型振蕩培養(yǎng)箱:東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；ZDX-35BI型高壓蒸汽滅菌鍋:上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng):接種一環(huán)菌株U-16至種子培養(yǎng)基中,于28℃、200 r/min培養(yǎng)20 h。

發(fā)酵培養(yǎng):接入10%的種子液(出芽率＞20%,死亡率＜1%,細(xì)胞數(shù)＞106個/mL),30 ℃、200 r/min培養(yǎng)48 h[10]。

菌株保藏:4℃斜面保藏。

1.3.2 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對產(chǎn)朊假絲酵母性能的影響

將種子液接種于上述6種不同的發(fā)酵培養(yǎng)基,發(fā)酵12 h加入25 μg/mL亞硒酸鈉[13],培養(yǎng)48 h,測定酵母的生物量、有機硒和GSH含量。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基響應(yīng)面優(yōu)化

釆用PB設(shè)計法對G改良發(fā)酵培養(yǎng)基的12個因子進行篩選,選取G改良培養(yǎng)基中的各因子含量為0水平,試驗設(shè)計及數(shù)據(jù)分析采用Design-expert8.0軟件,每組設(shè)計共3組重復(fù)試驗,結(jié)果取平均值。12個考察因素及其編碼水平見表1。

由PB篩選試驗確定影響富硒酵母生長的關(guān)鍵因子,之后考慮各因素效應(yīng)大小,確定下一步試驗水平的中心點及各個水平參數(shù)。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.3.4 亞硒酸鈉添加量對酵母生長的影響

培養(yǎng)基中硒含量過高,會對酵母生長產(chǎn)生抑制[4、11、14]。為確定酵母生長的最適硒添加量,在培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)上,進一步探究了亞硒酸鈉添加量(15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL、30 μg/mL、35 μg/mL、40 μg/mL)對酵母生長的影響。

1.3.5 測定方法

菌體干質(zhì)量(dry cell mass,DCM):菌液6 000 r/min離心5 min,洗滌菌體,烘干至質(zhì)量恒定。

GSH測定:采用高效液相色譜法[15]。

胞內(nèi)有機硒檢測方法:胞內(nèi)總硒和胞內(nèi)無機硒的測定方法參照文獻[11]。胞內(nèi)有機硒=胞內(nèi)總硒-胞內(nèi)無機硒。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對富硒產(chǎn)朊假絲酵母生物量的影響

表2 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對富硒產(chǎn)朊假絲酵母生長的影響Table 2 Effects of different fermentation mediums on the growth of selenium-enrichedC.utilis

由表2可知,酵母在G改良培養(yǎng)基中生長最好,硒轉(zhuǎn)化率高,生物量為8.91 g/L,有機硒含量為1 134.37 μg/g,GSH含量為124.01 mg/L；在S培養(yǎng)基中富硒效果較好,有機硒為1 225.56 μg/g,生物量較低7.07 g/L。綜合考慮選擇G改良配培養(yǎng)基進一步試驗。

2.2 高生物量富硒產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵培養(yǎng)基關(guān)鍵因子的確定

以G改良培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。采用二水平PB試驗設(shè)計對培養(yǎng)基各組分進行優(yōu)化,試驗設(shè)計與結(jié)果如表3所示。

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計方案及試驗響應(yīng)值Table 3 Design and response values of Plackett-Burman experiments

表4 富硒產(chǎn)朊假絲酵母生物量回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 4 Regression coefficient and their significance for biomass ofselenium-enrichedC.utilis

由表3、表4可知,試驗選取的12個因素中4個因素達(dá)到顯著性影響水平,顯著程度由高到低依次為葡萄糖(P＜0.000 1),KH2PO4(P=0.005),蛋白胨(P=0.017),CuSO4(P=0.023),其余各因素不顯著(P＞0.05),因此選擇這4個因素進行后續(xù)試驗。各因素對酵母的生長影響不同,葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MnSO4、CuSO4、肌醇、ZnSO4與酵母的生長呈正相關(guān),促進酵母生長,Box-Behnken(BB)試驗時應(yīng)提高水平；其余與酵母生長負(fù)相關(guān),下一步應(yīng)降低水平。酵母體內(nèi)存在兩種硒轉(zhuǎn)運方式——高硒親和系統(tǒng)和低硒親和系統(tǒng)；兩種轉(zhuǎn)運通道都離不開葡萄糖的作用,葡萄糖可以促進細(xì)胞對硒的吸收[16],但葡萄糖含量過高時,培養(yǎng)基滲透壓太大會造成微生物會脫水、脫離正常生理狀態(tài),因此BB試驗時保持葡萄糖含量水平不變。蛋白胨是含有一些維生素和糖類的有機氮化合物,對菌體生長影響較大,可以促進產(chǎn)朊假絲酵母的生長和對硒的富集[17]。磷、K+是構(gòu)成菌體核酸、輔酶、酶的激活劑,直接或間接影響著酵母細(xì)胞的生長和代謝。磷酸根離子影響啤酒酵母對硒的積累,KH2PO4有利于酵母對硒的吸收[18]。Cu2+是多種氧化酶的活性中心,適當(dāng)?shù)腃u2+可以促進酵母細(xì)胞的生長[19]。

2.3 響應(yīng)曲面法優(yōu)化富硒產(chǎn)朊假絲酵母生長工藝

2.3.1 預(yù)測模型的建立及回歸分析檢驗

根據(jù)PB試驗結(jié)果,采用Box-Behnken試驗,以富硒酵母生物量(R1)為響應(yīng)值,顯著影響因子的不同水平為自變量,進行優(yōu)化,每個自變量低、中、高水平分別為-1、0、1,試驗因素水平及編碼如表5所示,試驗結(jié)果響應(yīng)值見表6,方差分析見表7。

表5 Box-Behnken設(shè)計試驗因素與水平Table 5 Factors and levels of Box-Behnken experiments

以生物量(R1)為響應(yīng)值進行二元回歸擬合,獲得酵母生物量預(yù)測值對編碼自變量葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、CuSO4的二次多項回歸方程:

由表7模型的方差分析可知,試驗所采用的二次項模型具有顯著性(P＜0.000 1)；失擬項(P=0.148 3＞0.05)不顯著。其中校正決定系數(shù)R2adj=0.981 8,說明該模型擬合效果較好,該方程中的因變量與4個自變量之間線性關(guān)系顯著,方程可以用來解釋98.18%的變異,總變異中僅1.82%不能由該模型解釋。因此可以選用該回歸方程進行相應(yīng)的預(yù)測。

表6 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

表7 回歸方程方差分析及其顯著性檢驗Table 7 Variance analysis and significance testing of regression equation

對方程的回歸系數(shù)進行顯著性檢驗(表7)表明,一次項中A、B、C(P＜0.05),說明葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4對富硒酵母生長影響顯著,D項(P＞0.05)影響不顯著。交互項AD、BD(P＜0.05),表明葡萄糖和CuSO4,蛋白胨和CuSO4的交互作用對酵母生長影響顯著,其他交互項影響不顯著。二次項A2、B2、C2、D2(P＜0.05),說明4個因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系,曲面效應(yīng)顯著。響應(yīng)面結(jié)果見圖1。

圖1 葡萄糖和硫酸銅、蛋白胨和硫酸銅交互作用對富硒產(chǎn)朊假絲酵母生物量影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction between glucose and CuSO4,peptone and CuSO4on biomass of selenium-enrichedC.utilis

2.3.2 回歸模型驗證試驗

根據(jù)回歸模型得到富硒酵母生物量預(yù)測最大值為12.14 g/L,對應(yīng)4個因子的取值分別為葡萄糖31.04 g/L、蛋白胨16.81 g/L、KH2PO46.65 g/L、CuSO40.01 g/L。為方便實際操作,修改條件為葡萄糖30 g/L、蛋白胨17 g/L、KH2PO46.5 g/L、CuSO40.01 g/L。對上述條件進行驗證性試驗,優(yōu)化后生物量為12.01 g/L,GSH為134.27 mg/L,有機硒為1 337.46 μg/g,較優(yōu)化前分別提高了36%、14%和20%。

2.4 亞硒酸鈉對酵母生長的影響

由表8可知,亞硒酸鈉添加量較低時對酵母生長影響較小,胞內(nèi)GSH含量穩(wěn)定,但有機硒富集也較少；隨著添加量增加,有機硒含量增加；亞硒酸鈉添加量＞30μg/mL時,胞內(nèi)GSH顯著降低,菌體大量死亡。亞硒酸鈉添加量為30μg/mL時,酵母生物量為11.21 g/L,有機硒為1 673.32 μg/g,谷胱甘肽為126.80 mg/L。

表8 亞硒酸鈉添加量對朊假絲酵母性能影響Table 8 Effect of sodium selenite addition on the performances of C.utilis

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法對酵母生長培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果為葡萄糖30 g/L、蛋白胨17 g/L、KH2PO46.5 g/L、CuSO40.01 g/L。在此條件下酵母生物量為12.01 g/L,有機硒1 337.46 μg/g,谷胱甘肽134.27 mg/L。將培養(yǎng)基中亞硒酸鈉添加量由25 μg/mL提高至30 μg/mL,酵母生物量為11.21 g/L,有機硒為1 673.32 μg/g,谷胱甘肽為126.80mg/L。該研究為高性能富硒產(chǎn)朊假絲酵母深入研究奠定了基礎(chǔ)。

[1]MAREK K,KIELISZEK M,STANISIAW B.Current knowledge on the importance of selenium in food for living organisms:a review[J].Molecules,2016,21(5):609-624.

[2]KIELISZEK M,BLAZEJAK S,GIENTKA I,et al.Accumulation and metabolism of selenium by yeast cells[J].Appl Microbiol Biot,2015,99(13):5373-5382.

[3]ZHAN X A,QIE Y Z,WANG M,et al.Selenomethionine:an effective selenium source for sow to improve Se distribution,antioxidant status,and growth performance of pig offspring[J].Biol Trace Elem Res,2011,142(3):481-491.

[4]PéREZ-CORONA M T,SáNCHEZ-MARTíNEZ M,VALDERRAMA M J,et al.Selenium biotransformation bySaccharomyces cerevisiaeand Saccharomyces bayanusduring white wine manufacture:laboratory-scale experiments[J].Food Chem,2011,124(3):1050-1055.

[5]WANG Z,ZHANG L Y,TAN T W.High cell density fermentation of Saccharomyces cerevisiaeGS2 for selenium-enriched yeast production[J].Kor J Chem Eng,2010,27(6):1836-1840.

[6]WANG D H,YANG B,WEI G Y,et al.Efficient preparation of Selenium/glutathione-enrichedCandida utilisand its biological effects on rats[J].Biol Trace Elem Res,2012,150(1-3):249-257.

[7]WANG D H,ZHANG J L,DONG Y Y,et al.Glutathione is involved in physiological response ofCandida utilisto acid stress[J].Appl Microbiol Biot,2015,99(24):10669-10679.

[8]YIN H F,CHEN Z G,GU Z X,et al.Optimization of natural fermentative medium for selenium-enriched yeast by d-optimal mixture design[J].LWT-Food Sci Tech,2009,42(1):327-331.

[9]SUHAJDA A,HEGOCZKI J,JANZS B,et al.Preparation of seleniumenrichedSaccharomyces cerevisiae[J].J Trace Elem Med Biol,2000,14(1):43-47.

[10]鄒 艷,李俊杰,管 斌,等.高生物量富硒產(chǎn)朊假絲酵母菌株的選育[J].中國釀造,2017,36(5):85-89.

[11]楊 波.富硒產(chǎn)朊假絲酵母的制備及性能研究[D].蘇州:蘇州大學(xué),2012.

[12]CATALINO G,AKIHISA KANDA,et al.Effect of amino acids on glutathione production bySaccharomyces cerevisiae[J].Appl Microbiol Biotechnol,1992,36:538-540.

[13]吳寶強,梁海秋,楊 輝,等.高生物量富硒酵母的選育和培養(yǎng)條件的初步研究[J].現(xiàn)代食品科技,2005,21(2):35-39.

[14]KIELISZEK M,BIAZEJAK S,KUREK E.Binding and conversion of selenium inCandida utilisATCC 9950 yeast in bioreactor culture[J].Molecules,2017,22(3):1-11.

[15]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2015:512.

[16]ROSEN B R,LIU Z J.Transport pathways for arsenic and selenium:a minireview[J].Environ Int,2009,35(3):512-515.

[17]原國強,楊 輝,梁海秋,等.富硒酵母的選育及其發(fā)酵條件的優(yōu)化試驗[J].食品科技,2007,32(5):25-28.

[18]LAZARD M,BLANQUET S,FISICARO P,et al.Uptake of selenite by Saccharomyces cerevisiaeinvolves the high and low affinity orthophosphate transporters[J].J Biol Chem,2010,285(42):32029-32037.

[19]張 敏,王立芹.微量元素銅的營養(yǎng)學(xué)研究進展[J].中國飼料添加劑,2014(9):10-14.

[20]KIELISZEK M.B?AZ˙EJAK S,BZDUCHA-WRóBEL A,et al.Effects of selenium on morphological changes inCandida utilisATCC 9950 yeast cells[J].Biol Trace Elem Res,2016,169(2):387-393.