周書楠,席修璞,董 蘊(yùn),葉萬海,張振東,郭 壯*

(1.湖北文理學(xué)院 化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所,湖北 襄陽 441053；2.襄陽市食品藥品監(jiān)督管理局,湖北 襄陽 441021)

作為中國地理標(biāo)識產(chǎn)品和湖北省非物質(zhì)文化遺產(chǎn),湖北省棗陽市琚灣酸漿面以漿水、精制面條和香辣臊子等為主要成分,運(yùn)用傳統(tǒng)技藝加工制作而成。漿水是酸漿面品質(zhì)形成的關(guān)鍵,一方面賦予了酸漿面獨(dú)特的酸味,另一方面其浸泡發(fā)酵的芹菜亦是酸漿面中的佐料。漿水的制作環(huán)境較為開放,為了消除腐敗菌的污染,通常會向前日剩余的漿水中加入等體積的沸水,并放置8～10 h后使用。經(jīng)走訪調(diào)研發(fā)現(xiàn),酸漿面的制作和食用通常在每年的7～10月份,究其原因可能在于其他月份溫度過低不利于微生物的發(fā)酵,從而無法制得漿水。在解析微生物群落結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,對漿水中優(yōu)勢菌群進(jìn)行分離、鑒定、保藏和篩選,繼而采用高密度發(fā)酵技術(shù)和冷凍干燥技術(shù)相結(jié)合的手段進(jìn)行直投式發(fā)酵劑制備,同時輔以適宜的溫度,可能對實(shí)現(xiàn)琚灣酸漿面的全天候乃至工業(yè)化生產(chǎn)具有積極意義。由此可見,對琚灣酸漿面漿水細(xì)菌多樣性展開評價是極為必要的。

近年來興起的Miseq高通量測序技術(shù)不僅具有通量高的優(yōu)點(diǎn)[1],同時實(shí)現(xiàn)了多樣本微生物群落結(jié)構(gòu)的平行分析與評價[2],在酸奶[3]、臘腸[4]、葡萄酒[5]、窖泥[6]和泡菜[7]等發(fā)酵食品的微生物多樣性研究中有著廣泛的應(yīng)用,為評價琚灣酸漿面漿水中細(xì)菌多樣性提供了新的思路和技術(shù)手段。除此之外,在獲取細(xì)菌16S rRNA序列信息的基礎(chǔ)上,使用KOMODO(Known Media Database)等網(wǎng)站[8]對優(yōu)勢菌培養(yǎng)基的配方進(jìn)行預(yù)測,對后續(xù)漿水中優(yōu)勢微生物菌株的分離亦可能具有積極的意義。

本項(xiàng)目以琚灣酸漿面漿水為研究對象,采用Miseq高通量測序技術(shù)對其細(xì)菌多樣性進(jìn)行了評價,同時結(jié)合生物信息學(xué)和多元統(tǒng)計學(xué)手段對微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了平行分析。通過本研究的實(shí)施,以期全面解析酸漿面漿水中細(xì)菌的多樣性,為后續(xù)琚灣酸漿面的全年化生產(chǎn)提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙二胺四乙酸二鈉、異戊醇、氯仿、醋酸鈉、三羥甲基氨基甲烷(Tris)飽和酚、乙醇、三羥甲基氨基甲烷、十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基硫酸鈉:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit:德國QIAGEN公司；脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)、蛋白酶K、5×TransStartTM、FastPfu Buffer和FastPfu Fly DNA Polymerase:北京全式金生物技術(shù)有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)緩沖液:寶生物工程(大連)有限公司；338F/806R引物,其中正向引物中加入7個核苷酸標(biāo)簽(barcode):由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

5810R臺式高速冷凍離心機(jī):德國Eppendorf公司；DYY-12電泳儀:北京六一儀器廠；Vetiri梯度基因擴(kuò)增儀:美國AB公司；Miseq高通量測序平臺:美國Illumina公司；R920機(jī)架式服務(wù)器:美國DELL公司；ND-2000C微量紫外分光光度計:美國Nano Drop公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng):美國BIO-RAD公司；2100芯片生物分析儀:美國Agilent公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的采集

從湖北省棗陽市琚灣鎮(zhèn)采集10個酸漿面漿水樣品,漿水裝入采樣瓶中,置于含有冰袋的采樣箱中低溫運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室,12 h內(nèi)完成脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)提取工作。

1.3.2 DNA提取

50 mL漿水400 r/min離心10 min去除蔬菜殘?jiān)?取上清液10 000 r/min繼續(xù)離心10 min,使用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒對離心后得到的菌泥進(jìn)行微生物總DNA提取。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶明亮且無彌散現(xiàn)象,OD260nm/280nm在1.8～2.0且質(zhì)量濃度＞10 ng/μL的DNA樣品置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 細(xì)菌16S rRNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增及Miseq高通量測序

擴(kuò)增體系為20 μL:10×PCR緩沖液4 μL,2.5 mmol/L dNTP2μL,5μmol/L正向和反向引物各0.8μL,5U/μLDNA聚合酶0.4 μL,DNA模板10 ng,其余部分為ddH2O。

擴(kuò)增條件為:95℃變性3 min；95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸45 s,30個循環(huán)；72℃延伸10 min。檢測合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋至100 nmol/L后,使用干冰寄往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Miseq高通量測序。

1.3.4 序列的拼接及質(zhì)控

在序列進(jìn)行拼接過程中同時進(jìn)行質(zhì)控,若成對序列重疊區(qū)堿基數(shù)＜10 bp、最大錯配比率＞0.2、barcode存在堿基錯配或引物堿基錯配數(shù)＞2 bp的序列均會予以剔除。將切除barcode和引物后的序列,合并為一個fna文件進(jìn)行后續(xù)的生物信息學(xué)分析。

1.3.5 生物信息學(xué)分析

使用QIIME分析平臺[9]結(jié)合已建立的腳本程序?qū)?.3.4生成的fna文件進(jìn)行序列的生物信息學(xué)分析:在使用Py-NAST[10]對序列校準(zhǔn)排齊的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步使用兩步UCLUST法[11]歸并建立分類操作單元(operational taxonomic units,OTU)；從各OTU中選取代表性序列,使用RDP(Ribosomal Database Project,Release 11.5)[12]和Greengenes(Release 13.8)[13]數(shù)據(jù)庫對序列進(jìn)行同源性比對,通過對數(shù)據(jù)的整合進(jìn)而明確其種屬分類學(xué)地位；使用FastTree軟件[14]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,進(jìn)而對酸漿面漿水的Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)等α多樣性指標(biāo)進(jìn)行計算。

1.3.6 核酸登錄號

本研究中所有序列數(shù)據(jù)已提交至MG-RAST數(shù)據(jù)庫,ID號為mgp82912。

1.3.7 多元統(tǒng)計學(xué)分析

使用基于分類操作單元加權(quán)UniFrac距離的非加權(quán)組平均法(unweighted pair group method using arithmetic average,UPGMA)聚類對樣品進(jìn)行聚類分析,使用基于非加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析法(principal coordinate analysis,PCoA)對樣品進(jìn)行空間排布,使用多元方差分析(multivariateanalysis of variance,MANOVA)對隸屬于不同聚類樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)的顯著性進(jìn)行分析,使用歐式距離對不同聚類樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)的平均距離進(jìn)行計算,使用冗余分析(redundancy analysis,RDA)對導(dǎo)致樣品形成2個聚類的OTU進(jìn)行甄別。使用Mega7.0(http://www.megasoftware.net/)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹繪制,使用Origin 8.5軟件和Matlab 2010b軟件進(jìn)行其他圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列豐富度和多樣性分析

納入本研究的10個酸漿面漿水樣品16S rRNA測序情況及各分類地位數(shù)量如表1所示。

由表1可知,10個酸漿面漿水樣品共產(chǎn)生了388 306條高質(zhì)量16S rRNA序列,平均每個樣品產(chǎn)生38 831條。本研究采用兩步UCLUST歸并法建立了分類操作單元,其中采用100%相似性聚類得到了129 865條代表性序列,在此基礎(chǔ)上根據(jù)97%相似性聚類進(jìn)一步得到了7 014個OTU,平均每個樣品1 100個。由表1可知,樣品X3具有最大的細(xì)菌微生物豐度,其Chao 1指數(shù)為4 282,而X6樣品細(xì)菌微生物多樣性最高,其Shannon指數(shù)高達(dá)6.63。

表1 樣品16S rRNA測序情況及各分類地位數(shù)量Table 1 16S rRNA sequencing conditions and number of taxonomical levels

2.2 基于不同分類地位細(xì)菌菌群相對含量的分析

本研究產(chǎn)生的388306條序列,經(jīng)同源性比對后,將其鑒定為11個門,20個綱,26個目,45個科和61個屬,僅有0.036%的序列不能鑒定到屬水平,其中有99.72%的細(xì)菌隸屬于硬壁菌門(Firmicutes)的乳酸桿菌屬(Lactobacillus)。由此可見,琚灣酸漿面漿水中的細(xì)菌幾乎全部為乳酸桿菌。在得到7020個OTU的基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步對平均相對含量＞1.0%的OTU相對含量進(jìn)行了分析,其結(jié)果如圖1所示。

圖1 酸漿面漿水樣品中相對含量＞1.0%的OTUFig.1 OTU with relative abundance more than 1.0%in Suanjiangmian Jiangshuisamples

由圖1可知,酸漿面漿水中平均相對含量＞1.0%的OTU包括OTU6714、OTU2729、OTU3444、OTU3502、OTU6031、OTU1714、OTU5237和OTU3119,8個OTU的累計平均相對含量高達(dá)63.79%。以Illumina MiSeq為代表的二代測序技術(shù)具有讀數(shù)短的缺點(diǎn),其無法完成16S rRNA的全長測序,因而為了保證結(jié)果的可靠性,一般僅在分類學(xué)地位“屬”及以上水平對微生物的分類學(xué)地位進(jìn)行確定。本研究進(jìn)一步選取了8個平均相對含量＞1.0%的OTU中的代表性序列,構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹,其結(jié)果如圖2所示。

圖2 相對含量＞1.0%OTU的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of OTU with relative abundance more than 1.0%

由圖2可知,雖然不能將OTU鑒定到種水平,但OTU6031、OTU1714、OTU3444和OTU3502可以與德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)形成一個聚類,OTU6714與嗜淀粉乳桿菌(L.amylolyticus)形成一個聚類,OTU2729可以與干酪乳桿菌(L.casei)和副干酪乳桿菌(L.paracasei)形成一個聚類,OTU3119可以與口乳桿菌(L.oris)形成一個聚類。如果一個OTU在10個酸漿面漿水樣品中均存在,則將其定義為核心OTU。本研究進(jìn)一步統(tǒng)計了OTU在10個酸漿面漿水樣品中出現(xiàn)的次數(shù),其結(jié)果如圖3所示。

圖3 OTU在10個樣品中出現(xiàn)次數(shù)統(tǒng)計Fig.3 Occurrence frequency statistics of OTU in 10 samples

由圖3可知,10個樣品共有18個核心OTU,雖然僅占OTU總數(shù)的0.26%,但其包含了212 778條序列,占所有質(zhì)控后合格序列數(shù)的54.80%。此外,在10個樣品中出現(xiàn)9次、8次、7次和6次的OTU各有23個、39個、57個和99個,分別占OTU總數(shù)的0.33%、0.56%、0.81%和1.41%,4類OTU共包含95 555條序列,占所有質(zhì)控后合格序列數(shù)的24.61%。雖然在10個樣品中僅出現(xiàn)1次的OTU多達(dá)5 435個,占到OTU總數(shù)的77.49%,但其僅包含12 967條序列,平均每個OTU包含2.4條序列。由此可見,在OTU水平上,10個酸漿面漿水樣品共有大量的細(xì)菌類群,其累計平均相對含量達(dá)到54.80%。本研究進(jìn)一步對18個核心OTU進(jìn)行了分析,其在各酸漿面漿水樣品中相對含量的熱圖如圖4所示。

圖4 核心OTU在各樣品中相對含量的熱圖Fig.4 Heat map of the relative contents of core OTUs in 10 samples

由圖4可知,18個核心OTU均隸屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus),除OTU6714的平均相對含量達(dá)45.70%外,其他核心OTU的平均相對含量均＜1.0%。值得一提的是,不同樣品中OTU6714的含量亦存在較大的差異,其在X3、X7和X9樣品中達(dá)87%,而在X5和X8樣品中的含量均＜0.01%。2.3酸漿面漿水細(xì)菌菌群群落結(jié)構(gòu)的研究

在對酸漿面漿水中不同分類地位細(xì)菌菌群相對含量進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步采用UPGMA聚類分析和主坐標(biāo)分析對其細(xì)菌菌群群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,基于分類操作單元加權(quán)UniFrac距離的UPGMA聚類分析如圖5所示。

圖5 基于分類操作單元加權(quán)UniFrac距離的UPGMA聚類分析Fig.5 UPGMA clustering analysis of OTUs based on weighting UniFrac distance

由圖5可知,10個樣品整體上可以分為2個聚類,其中聚類I由樣品X3、X4、X7、X9和X10構(gòu)成,聚類II由樣品X1、X2、X5、X6和X8構(gòu)成。由此可見,雖然若干酸漿水樣品存在大量的核心細(xì)菌菌群,但某些樣品間微生物的群落結(jié)構(gòu)存在較大的差異。本研究進(jìn)一步使用基于非加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析對10個樣品的空間排布進(jìn)行了研究,結(jié)果如圖6所示。

圖6 基于分類操作單元加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析Fig.6 Principal coordinate analysis of OTUs based on weighting UniFrac distance

由圖6可知,隸屬于不同聚類的酸漿面漿水樣品在空間排布上呈現(xiàn)出明顯的分離趨勢,這進(jìn)一步證實(shí)了隸屬于聚類I和聚類II的樣品其微生物群落結(jié)構(gòu)構(gòu)成存在較大的差異,通過MANOVA驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)兩者差異極顯著(P＜0.001)。值得一提的是,本研究進(jìn)一步采用歐式距離對兩個聚類樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)的平均距離進(jìn)行了計算,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隸屬于聚類I的樣品組間平均距離為0.825±0.020,而聚類II為0.815±0.025,經(jīng)顯著性分析發(fā)現(xiàn)兩者差異不顯著(P＞0.05)。

雖然隸屬于不同聚類的酸漿面漿水其微生物群落結(jié)構(gòu)明顯不同,然而究竟是由于那些OTU不同導(dǎo)致了該現(xiàn)象的發(fā)生是本研究亟待解決的問題。通過設(shè)置聚類I/聚類II作為起約束作用的解釋變量,本研究進(jìn)一步使用RDA用于預(yù)測和解釋全部平均含量＞1.0%的OTU數(shù)據(jù)組成的響應(yīng)變量,從而對能顯著解釋不同聚類間酸漿面漿水細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異的最小變量組合進(jìn)行確定[15]。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn),數(shù)據(jù)中有19.3%的變異度能夠被聚類I/聚類II分組所解釋,而通過蒙特卡羅置換檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這一約束因素具有顯著性(P=0.024)。RDA雙序圖如圖7所示。

圖7 冗余分析雙序圖Fig.7 Biplot of the redundancy analysis

由圖7可知,在平均相對含量＞1.0%的OTU中,OTU6714和OTU1714與RDA排序圖約束軸上的樣本賦值良好相關(guān),2個OTU均隸屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)。由此可見,正是由于上述2個OTU在不同樣品中的分布及含量不同,進(jìn)而導(dǎo)致了隸屬于聚類I和聚類II的樣品其微生物群落結(jié)構(gòu)明顯不同。由圖7可知,在RDA排序圖中OTU6714位于圖的右側(cè)(即聚類I)而OTU1714位于圖的左側(cè)(即聚類II),這說明OTU6714的相對含量在隸屬于聚類I的樣品中較高,而OTU1714呈現(xiàn)出相反的趨勢,通過Mann-Whitney驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)2個OTU在不同聚類的酸漿面漿水樣品間差異非常顯著(P＜0.01)。

3 結(jié)論

在進(jìn)行微生物基因組DNA提取的基礎(chǔ)上,本研究使用高通量測序技術(shù),對琚灣酸漿面這一中國地理標(biāo)識產(chǎn)品的漿水細(xì)菌多樣性進(jìn)行了評價。結(jié)果發(fā)現(xiàn),琚灣酸漿面漿水中的細(xì)菌微生物中乳酸桿菌相對含量達(dá)99.72%,雖然不同樣品共有54.80%的核心細(xì)菌類群,但由于部分乳酸桿菌屬細(xì)菌的不同導(dǎo)致其可以劃分為兩個聚類,且隸屬于不同聚類的樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著的差異。通過本研究的開展,可為后續(xù)酸漿面漿水用發(fā)酵劑的制備提供一定理論參考,進(jìn)而使酸漿面的全年化生產(chǎn)成為可能。

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