苗利華,張金源,李 娜,馮 欣,2,孟慶恒,2*,孫建華,2

(1.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,天津 300387；2.天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300387)

植物寄生線蟲是重要的植物病原物之一,分布廣,種類多,廣泛寄生在農(nóng)作物、蔬菜、果樹、林木、花卉及藥材上,給農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

目前,有關(guān)植物寄生線蟲的防治主要是化學(xué)殺線蟲劑,但是大部分存在高毒、高殘留、高污染等諸多缺點(diǎn),使得化學(xué)殺線劑的應(yīng)用受到一定程度的限制[2-4]。因此,防治效果好、對(duì)環(huán)境友好的生物源殺線劑受到了人們的重視[5],并且已在病原線蟲防治方面得到了廣泛的研究和應(yīng)用[6]。海洋枝頂孢霉(Acremoniumsp.)BH0531是一株已經(jīng)證實(shí)的對(duì)松材線蟲和根結(jié)線蟲均有較好殺線活性的菌株[7]；其發(fā)酵液對(duì)根結(jié)線蟲卵囊和分散卵的孵化以及J2幼蟲均具有明顯抑制作用,對(duì)J2幼蟲的殺線作用高于實(shí)驗(yàn)條件下滅線磷及阿維菌素的測(cè)定值[8],因此,對(duì)該菌株進(jìn)行殺線蟲活性的研究具有潛在的價(jià)值。在前期試驗(yàn)中得出該菌株利用不同發(fā)酵培養(yǎng)基殺線效果不一,其中海水培養(yǎng)基生物量和殺線活性最高,馬鈴薯培養(yǎng)基次之,查氏培養(yǎng)基產(chǎn)量最低[9]。但在工業(yè)化生產(chǎn)中,土豆和海水培養(yǎng)基都不適合大規(guī)模發(fā)酵,存在操作繁瑣、腐蝕設(shè)備等缺點(diǎn)。而合成培養(yǎng)基不僅可以有效地避免這些問題且各營養(yǎng)成分明確,可以更方便準(zhǔn)確地控制。因此,試驗(yàn)選用察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基,擬利用響應(yīng)面分析法對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基及工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,從而提高發(fā)酵液的殺線效率,以期為菌株后續(xù)工業(yè)化放大研究提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

海洋真菌枝頂孢霉(Acremoniumsp.)BH0531(菌種保藏號(hào)CGMCC-5445)、灰葡萄孢霉(Batrytis cinerea,BC)菌:天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 供試線蟲

松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus):天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200 g/L煮汁,葡萄糖20 g/L,瓊脂15 g/L,MgSO40.05 g/L,pH自然,蒸餾水定容至1 000 mL,121℃、0.1 MPa滅菌20 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:NaNO32 g/L,K2HPO41 g/L,MgSO40.5 g/L,KCl 0.5 g/L,FeSO40.01 g/L,葡萄糖20 g/L,pH值自然,121℃、0.1 MPa滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱:上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DME/MVC2000型顯微鏡:德國徠卡公司；IS-RDV1立式單門雙層恒溫振蕩器:美國精騏有限公司；TOMY SX-500高壓滅菌鍋:日本TOMY Digital Biology公司；UEOS-503型中空纖維膜組件:天津膜天膜工程技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵濾液的制備

取新的菌株斜面,加無菌水洗下孢子,制成1×106個(gè)/mL的孢子懸液,將孢子懸液以試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的接種量接入裝液量為50 mL/250 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中。26℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)。將發(fā)酵液除去菌體收集濾液,先經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,再經(jīng)6 000 Da的超濾膜組件過濾,即為用于殺線蟲效果分析所需發(fā)酵液。

1.3.2 殺線蟲活性的測(cè)定

將收集到的線蟲配制成1 000條/mL的線蟲懸液。取96孔培養(yǎng)板,每孔板加入100 μL待測(cè)生物樣品和100 μL線蟲懸液(約100條),計(jì)數(shù)時(shí)向小孔內(nèi)加入幾滴無菌水,統(tǒng)計(jì)線蟲死亡數(shù),殺線率計(jì)算公式如下:

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

(1)Plackett-Burman試驗(yàn)[10]

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中的10個(gè)因素進(jìn)行考察,每個(gè)因素取高低2個(gè)水平,高水平約為低水平的1.5倍[11]。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

(2)最陡爬坡試驗(yàn)

最陡爬坡試驗(yàn)是通過對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的各因素結(jié)果進(jìn)行分析,根據(jù)獲得的主要因子的效應(yīng)值來確定爬坡路徑和步長,以快速逼近最佳區(qū)域[12]。

(3)Box-Behnten試驗(yàn)

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)確定的試驗(yàn)因素與水平,采用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理和軟件分析,以主要影響因素為自變量,以殺線率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn),擬合自變量與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系[13]。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理,利用Desigin-Expert version 8.0.6設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及相關(guān)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)篩選主要影響因子

根據(jù)單因子試驗(yàn)結(jié)果,本試驗(yàn)選用次數(shù)N=12的試驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì)蔗糖(A)、NaNO3(B)、蛋白胨(C)、K2HPO4(D)、MgSO4(E)、KCl(F)、FeSO4(G)、接種量(H)、初始pH(I)、發(fā)酵時(shí)間(J)、空項(xiàng)(K)等10個(gè)因素進(jìn)行考察,每組試驗(yàn)設(shè)計(jì)3次重復(fù)來測(cè)定發(fā)酵液的殺線率(Y)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。借助Desigin-Expert version 8.0.6設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,結(jié)果見表3。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)各因素效應(yīng)分析Table 3 Effect analysis of each factor of Plackett-Burman experiments

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)選取中心點(diǎn)

由表3可知,各因素對(duì)殺線活性影響的大小順序?yàn)镵2HPO4＞NaNO3＞培養(yǎng)時(shí)間＞接種量＞KCl＞FeSO4＞蔗糖＞MgSO4＞蛋白胨＞初始pH。其中影響最大的為K2HPO4、NaNO3、培養(yǎng)時(shí)間這3個(gè)因素,需進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)優(yōu)化分析,結(jié)果見表4。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of steepest ascent experiments

由表4可知,各因素在第3組試驗(yàn)附近取值時(shí),發(fā)酵液殺線率最高,因此選取這一組試驗(yàn)條件作為中心組合試驗(yàn)的中心點(diǎn),進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.3 Box-Behnken試驗(yàn)確定最優(yōu)組合

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)篩選出的試驗(yàn)中心點(diǎn),采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),利用Design-Expert version 8.0.6軟件進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn),其他因素取值為最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果,共進(jìn)行17次試驗(yàn),試驗(yàn)因素與水平見表5,試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6,方差分析結(jié)果見表7。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 5 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

根據(jù)表6試驗(yàn)結(jié)果,運(yùn)用Desigin-Expert version 8.0.6設(shè)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸擬合后得到的二次響應(yīng)面的三元二次回歸方程為:

通過對(duì)模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析,由表7可知,模型極顯著(P＜0.01),其中因素X2、X2X3、X12對(duì)發(fā)酵液的殺線率影響極顯著(P＜0.01),X1、X1X3、X32對(duì)殺線率的影響顯著(P＜0.05),失擬項(xiàng)P值為0.263 5,影響不顯著(P＞0.05),表明多元回歸方程具有顯著性,模型能較好的分析和預(yù)測(cè)響應(yīng)值。模型決定系數(shù)R2為0.965 0,校正決定系數(shù)R2adj為0.920 1,表明模型能解釋96.50%的響應(yīng)值的變化,模型可信度高。一般情況下,變異系數(shù)＜10%就可以說明模型具有良好的重復(fù)性[14]。經(jīng)方差分析得到的變異系數(shù)為2.73＜10,表明模型準(zhǔn)確度高,變異可能性低。信噪比(RSN)為17.543＞4,說明此模型具有較好的擬合度[15]。

利用Desigin-Expert version 8.0.6軟件,通過PB試驗(yàn)以及Box-Behnken響應(yīng)面二次回歸方差分析,得到可選擇的最優(yōu)組合為NaNO33.4 g/L,K2HPO41.5 g/L,發(fā)酵時(shí)間130 h,其他條件為PB試驗(yàn)得到的結(jié)果,即發(fā)酵條件為蔗糖25 g/L、蛋白胨1 g/L、MgSO40.4 g/L、KCl 0.6 g/L、FeSO40.025 g/L、接種量4%、初始pH 7、轉(zhuǎn)速120 r/min,溫度為26℃,裝液量為50mL/250mL時(shí)發(fā)酵液殺線活性最高。在此條件下發(fā)酵液的殺線率理論預(yù)測(cè)值為90.58%,與實(shí)際測(cè)定值88.00%相比,其相對(duì)誤差為2.58%,說明該模型能較好地模擬和預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。

2.4 響應(yīng)面因素交互作用分析

由圖1可知,對(duì)發(fā)酵液殺線活性影響比較大的因素為K2HPO4,其次為NaNO3,影響最小的為發(fā)酵時(shí)間,其中NaNO3和發(fā)酵時(shí)間、K2HPO4和發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)發(fā)酵液殺線活性影響顯著,這與表7的分析結(jié)果相吻合。

圖1 發(fā)酵時(shí)間、硝酸鈉和磷酸氫二鉀用量交互作用對(duì)殺線率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation time,NaNO3and K2HPO4addition on nematode mortality rate

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以松材線蟲為靶標(biāo)線蟲,在單因子的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面法對(duì)海洋枝頂孢霉(Acremoniumsp.)BH0531產(chǎn)殺線活性物質(zhì)的發(fā)酵條件進(jìn)行了研究,結(jié)果得到優(yōu)化后發(fā)酵液殺線率為88.00%,比方程預(yù)測(cè)值90.58%略低,而原始發(fā)酵條件下的殺線率為65.33%,說明優(yōu)化后的發(fā)酵液殺線率活性比優(yōu)化前提高了22.77%。但本研究是在實(shí)驗(yàn)室搖瓶條件下進(jìn)行,要實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模開發(fā)生產(chǎn),還需進(jìn)一步培養(yǎng)工藝的研究。

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