王 偉，李東斌，羅秀梅，劉競麗

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)科，南寧 530021)

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、損傷及其相關藥理學研究中，常常需要對腦脊液的性狀及成分進行分析[1]。在動物實驗中，大鼠是常用的實驗動物，然而大鼠腦室及蛛網(wǎng)膜下腔狹小，血管豐富，采集腦脊液時易損傷血管，造成血液污染，往往影響后續(xù)實驗結果[2]；并且腦脊液抽取過程復雜，容易傷及延髓致大鼠死亡。目前常用的腦脊液抽取方法包括經(jīng)皮延髓池穿刺法、經(jīng)皮經(jīng)側腦室穿刺法、直視下劃破硬脊膜抽取腦脊液法、直視下微量進樣器經(jīng)硬脊膜穿刺抽取腦脊液法等等。經(jīng)皮延髓池穿刺法對大鼠的創(chuàng)傷性小，能在短時間內(nèi)完成腦脊液的收集，但技術難度高，成功率低。Li等[3]提出的腦脊液收集裝置通過負壓吸引可明顯提高經(jīng)皮延髓池穿刺法的成功率；本研究通過對該裝置進行改良，旨在進一步提高大鼠腦脊液收集的成功率。

注：A：改良負壓吸引裝置的構造；B：由1 mL注射器針帽制作成的限位器；C：流量調(diào)節(jié)器；D：大鼠腦脊液抽取示意圖；E：穿刺針頭打磨成45°角，尖端鈍化；F：打磨前的穿刺針頭。圖1 改良負壓吸引裝置的制作Note. A: Structure of the modified suction device. B: The limitator made out of the protective sheath of a 1-mL syringe. C: A flow regulator for adjustment of the intensity of negative pressure. D: Schematic diagram of rat CSF collection. E: The needle tip is rubbed to be about 45° and less sharp for puncture. F: Shape of the needle tip before modification.Fig.1 Construction of the modified suction device with negative pressure

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SD大鼠36只，雄性，體重250～280 g，清潔級，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供 [SCXK (桂) 2014-0002]。腦脊液抽取在廣西醫(yī)科大學實驗動物中心實驗室內(nèi)進行 [SYXK (桂) 2014-0003]，動物飼養(yǎng)按照實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。大鼠按腦脊液抽取方法不同隨機分成3組，每組12只。

1.2 主要試劑與儀器

水合氯醛(中國成都市科龍化工試劑廠，分析純)。1 mL一次性注射器(中國北侖河廣西巨龍醫(yī)療器械有限公司)；26 G一次性靜脈輸液針(中國恩康湖南岳陽民康醫(yī)用材料有限公司)；流量調(diào)節(jié)器取自一次性使用連接管(中國潔瑞山東威高集團醫(yī)用高分子制品股份有限公司)；STT-1大鼠手術臺(廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供)；高速冷凍離心機(德國Eppendorf 5417R)。

1.3 實驗方法

1.3.1 改良負壓吸引裝置的制作

用鋼絲鉗將26 G靜脈輸液針(0.45 × 15 mm，褐色柄)在距針柄4 mm處剪斷，用砂輪打磨斷端，使傾角呈45°，減少其鋒利程度(圖1E、1F)，使穿刺時有更強的突破感并且不易對腦組織及血管造成損傷[4]。在輸液管上距棕色針柄末端5 cm及6 cm處用記號筆預先做好標記(圖1A)，將流量調(diào)節(jié)器(圖1C)套入輸液管末端，卡緊，接入1 mL一次性注射器；用注射器的針帽按圖1B制作成一個限位器，注射器抽成負壓時將限位器套入活塞尾部，使針管內(nèi)維持恒定的負壓。

1.3.2 腦脊液的收集

(1)經(jīng)皮穿刺延髓池抽取腦脊液法：用10%的水合氯醛(35 mg/kg，腹腔注射)麻醉大鼠，然后參照富宏等[2]的研究方法進行操作。用左手握住大鼠頭部，并將大鼠的頭部向胸部屈曲，右手探及枕骨隆凸與第1頸椎之間的凹陷(枕骨大孔)，沿平行大鼠頭部方向從凹陷處將1 mL注射器針頭小心地刺入小腦延髓池，緩慢抽取腦脊液，后轉移至離心管。

注：A：經(jīng)皮穿刺延髓池抽取腦脊液法；B：負壓吸引裝置穿刺抽取腦脊液法；C：改良負壓吸引裝置穿刺抽取腦脊液法。圖2 不同腦脊液收集方法示意圖Note. A: Drawing from the cerebellomedullary cistern via percutaneous puncture. B: Using a suction device with negative pressure. C: Using a modified suction device with negative pressure.Fig.2 Diagram of three different methods of cerebrospinal fluid collection in rats

(2)負壓吸引裝置穿刺抽取腦脊液法：用10%的水合氯醛(35 mg/kg，腹腔注射)麻醉大鼠，用左手握住大鼠頭部，并將大鼠的頭部向胸部屈曲，探及凹陷處，按Li等[3]的方法操作，右手持腦脊液收集裝置的針頭沿大鼠鼻側方向從第1頸椎上緣緩慢進針，當有明顯的突破感時停止進針，助手打開夾子，腦脊液會被快速地吸引至輸液管內(nèi)，當管內(nèi)腦脊液停止流動時再次夾閉輸液管，拔針，取下限位器，將管內(nèi)的腦脊液轉移至離心管。

(3)改良負壓吸引裝置穿刺抽取腦脊液法：按改良前的方法進行操作，進針后有明顯的突破感時停止進針，助手打開流量調(diào)節(jié)器，只給一個較小的負壓，并根據(jù)腦脊液進入管腔的速度調(diào)整調(diào)節(jié)器，使腦脊液緩慢進入輸液管，當液面達到標志處時，立即關閉調(diào)節(jié)器，拔針，取下限位器，將管內(nèi)的腦脊液轉移至離心管。

1.3.3 判斷標準

對腦脊液進行分析時要求有一定的純凈度及采集量，當樣本中混有血液將直接影響后續(xù)實驗結果，故本研究根據(jù)是否有血污染來判斷樣本是否合格，根據(jù)實際情況分為4種情況：①未能成功抽取腦脊液；②抽取的腦脊液混有血液，肉眼觀呈紅色；③抽取的腦脊液肉眼觀透明，離心(4℃，800 r/min，10 min)[5]后管底有紅細胞沉淀；④抽取的腦脊液肉眼觀透明，離心后未見沉淀。第4種情況視為成功抽取合格腦脊液。

1.4 統(tǒng)計學方法

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，腦脊液質(zhì)量的比較用完全隨機設計多樣本秩和檢驗(Kruskal-Wallis法)，兩兩比較用擴展t檢驗。P< 0.05為差異有顯著性。

2 結果

經(jīng)皮穿刺延髓池抽取腦脊液法：12只大鼠4只未能抽取到腦脊液，6只抽取出血性腦脊液，僅有2只抽出少量清亮腦脊液，在離心后仍可見紅細胞沉淀。未能成功抽取合格腦脊液。

負壓吸引裝置穿刺抽取腦脊液法：12只大鼠除1只未能抽出腦脊液外，11只均能抽取，其中4只在中后期因速度過快混有較多血液，7只抽取至肉眼觀清亮腦脊液，在離心后仍有3只可見紅細胞沉淀。成功率33.3%。

改良負壓吸引裝置穿刺抽取腦脊液法：12只大鼠1只因操作原因未能很好地控制速度抽取到血性腦脊液，其它11只均可獲得清亮腦脊液，離心后2只可見紅細胞沉淀。成功率75%。

以上3種方法抽取腦脊液結果見表1。經(jīng)完全隨機設計多樣本秩和檢驗，3種方法差異有顯著性(P< 0.01)。3種方法之間的兩兩比較用擴展t檢驗，均為P< 0.05，差異有顯著性，見表2。

表1 3種方法收集大鼠腦脊液結果

表2 不同腦脊液收集方法的兩兩比較

3 討論

腦脊液由腦室的脈絡叢上皮細胞產(chǎn)生分泌，經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔循環(huán)，由蛛網(wǎng)膜粒重吸收入血。腦脊液提供腦組織一定的營養(yǎng)，運走腦組織的代謝產(chǎn)物。腦脊液的改變往往直接反應了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的變化，因此對腦脊液進行分析是動物實驗研究的常用技術[6]。據(jù)文獻報道，體重300 g大鼠腦脊液總體積大約580 μL[7]，而一次能從延髓池中抽取的腦脊液更少，在100～120 μL[8]。相對于直視下劃破硬脊膜抽取腦脊液法及直視下微量進樣器經(jīng)硬脊膜穿刺抽取腦脊液法，直接從皮膚穿刺進入延髓池抽取腦脊液操作簡單，對腦立體定位儀依賴程度低，免去了繁瑣的手術過程，創(chuàng)口小，減少了感染機會。但是經(jīng)皮穿刺延髓池抽取腦脊液技術難度較高，要求術者不僅要熟悉大鼠項部的解剖結構，還要掌握進針的部位、深度與穿刺方向[9]。此法抽取腦脊液失敗的常見原因有：①定位不準確；②進針方向不合適；③穿刺過淺或過深；④抽取過程用力過度，腦室內(nèi)負壓過大使腦內(nèi)血管破裂出血。

Li等[3]提出的腦脊液負壓吸引收集裝置根據(jù)大鼠體重保留了不同的針尖長度，將傾角打磨成45°，減少了鋒利程度，增強了進針時的突破感，很好地控制了進針深度；恒定的負壓避免了手動抽吸用力不均的情況；且創(chuàng)口微小，有較好的重復性。效果優(yōu)于經(jīng)皮延髓池穿刺法(表2)，但較強的負壓與較快的抽取速度難免會使腦內(nèi)壓力迅速降低，使腦內(nèi)血管破裂，增加了抽取過程中后期出血的風險。

改良后的負壓吸引收集裝置由于增加了流量調(diào)節(jié)器，抽取過程隨時可以調(diào)整負壓大小，可將抽取速度精確地控制在50 μL/min左右[5]。預先在輸液管上5 cm、6 cm處做好標記，分別等同于腦脊液的量達到100 μL、120 μL。當液面到達標記處時，即關閉調(diào)節(jié)器，停止抽液，有效防止了腦內(nèi)壓力過快過多地降低導致的出血，效果優(yōu)于改良前的負壓吸引收集裝置及傳統(tǒng)經(jīng)皮延髓池穿刺法，差異有顯著性(表2)。另外，即便后期有少許出血，也能及時處理，此時可考慮用止血鉗從有血液污染處夾閉輸液管，將污染端剪下。值得注意的是，在打開調(diào)節(jié)器之后，如果未見腦脊液吸出，不必繼續(xù)增大負壓，這可能是因為針孔接觸到了延髓，只需稍微將針尖后退或稍微旋轉即可。

綜上所述，改良后的負壓吸引收集裝置由于控制了負壓的強度而有效降低了出血的風險，能夠便捷、高效地收集到合格的大鼠腦脊液；裝置的材料簡單容易獲得，短時間內(nèi)即可完成制作；替換針頭方便；對于操作者技術要求不高，只需熟悉裝置的操作稍加練習即可順利完成腦脊液的收集，從而保證實驗順利進行。

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[2] 富宏, 陶迎紅, 王學美, 等. 經(jīng)皮穿刺延髓池抽取兔和大鼠腦脊液的方法 [J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2006, 16(11): 684-687.

[3] Li Y, Zhang B, Liu XW, et al. An applicable method of drawing cerebrospinal fluid in rats [J]. J Chem Neuroanat, 2016, 74: 18-20.

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