劉存存， 楊國杰，李棟博， 李國棟， 秦鵬，魏子寒

冠心病是目前危害人類健康、導(dǎo)致人類死亡的主要疾病之一。近年來隨著對冠心病的研究深入，經(jīng)皮冠狀動脈內(nèi)血管成形術(shù)、冠狀動脈內(nèi)支架置入術(shù)、冠狀動脈旁路移植術(shù)等已成為臨床治療冠心病的主要手段，但對于存在多支病變的患者來說，介入治療并不能實(shí)現(xiàn)完全血運(yùn)重建，因此冠狀動脈側(cè)支循環(huán)（CCC）的建立對于冠狀動脈嚴(yán)重狹窄的患者尤為重要，其可有效減少心肌梗死面積，抑制心肌重塑，緩解心肌缺血，改善心功能，降低死亡率[1-3]。CCC的建立受血流切應(yīng)力、炎癥以及生長因子等多種因素的影響[4]，但CCC形成的分子機(jī)制尚不清楚。Jagged1是哺乳動物細(xì)胞膜上Notch受體中第一個被證實(shí)的配體，在神經(jīng)發(fā)育、肌肉形成、血管新生等方面發(fā)揮重要作用。Jagged1受多種因素影響，如炎癥因子、腫瘤壞死因子-α、缺氧、高脂血癥等，內(nèi)皮細(xì)胞損傷后Jagged1水平升高，參與內(nèi)皮細(xì)胞損傷修復(fù)，促進(jìn)血管新生[5，6]。但Jagged1蛋白是否參與冠心病患者CCC形成目前未有報道，因此本文通過觀察嚴(yán)重冠狀動脈狹窄患者血漿Jagged1蛋白水平與CCC形成的關(guān)系，進(jìn)一步揭示CCC形成的機(jī)制，為冠心病患者臨床治療提供新的研究方向。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2016-06-01至2016-10-30在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年心血管科接受選擇性冠狀動脈造影檢查，結(jié)果顯示左前降支、左回旋支或右冠狀動脈中至少有一支血管直徑狹窄≥95%的冠心病患者89例（冠心病組），其中男53例，女36例，年齡（58.87±9.00）歲。另選造影結(jié)果無明顯異常的30例患者為正常對照組，其中男13例，女17例，年齡（57.37±7.49）歲。 排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往接受過經(jīng)皮冠狀動脈介入治療；（2）既往行冠狀動脈旁路移植術(shù)；（3）合并冠狀動脈心肌橋或先天性冠狀動脈畸形；（4）合并瓣膜性心臟?。唬?）急性心肌梗死；（6）合并急慢性感染、腫瘤、免疫性疾??；（7）腦梗死、腦出血；（8）嚴(yán)重肝腎功能不全、心力衰竭；（9）腎動脈狹窄等其他動脈狹窄相關(guān)疾病。

1.2 資料收集

征得患者同意后，詳細(xì)記錄臨床資料，包括年齡、性別、高血壓史、糖尿病史、吸煙，所有患者入院后常規(guī)檢查指標(biāo)，包括總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、空腹血糖、超敏C-反應(yīng)蛋白（hs-CRP）。

1.3 CCC分級

采用Rentrop分級方法評價CCC。Rentrop分級分為4個不同等級：0級為無側(cè)支循環(huán)；1級為分支動脈充盈，而主要的心外膜動脈無充盈；2級為心外膜動脈部分充盈；3級為心外膜動脈完全充盈。手術(shù)由同一術(shù)者進(jìn)行并且由2名以上的臨床醫(yī)生采用單盲法對每位入選患者進(jìn)行CCC分級評分。根據(jù)造影結(jié)果將冠心病組患者分成2個亞組：側(cè)支循環(huán)良好亞組（Rentrop分級≥2級）42例，側(cè)支循環(huán)不良亞組（Rentrop分級≤1級）47例。

1.4 標(biāo)本收集及保存

所有入選患者均于入院后第二天空腹抽取靜脈血5 ml于抗凝管中，30 min內(nèi)1 000 g離心15 mim，取血漿分裝至PP管中放入-80℃冰箱保存。

1.5 血漿Jagged1蛋白和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）水平檢測

Jagged1蛋白檢測試劑盒及VEGF試劑盒均由上?？ㄅ锟萍加邢薰咎峁?，具體操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。記錄450 nm的OD值，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待測樣品水平。酶聯(lián)免疫吸附法測定（ELISA）試劑盒板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于15%。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析，計量資料符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組之間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；多組之間均數(shù)比較采用方差分析；計數(shù)資料以率表示，組間比較采用 χ2檢驗(yàn)。采用Pearson法和多元回歸進(jìn)行相關(guān)性分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 側(cè)支循環(huán)良好亞組與側(cè)支循環(huán)不良亞組患者臨床資料比較（表1）

側(cè)支循環(huán)良好亞組與側(cè)支循環(huán)不良亞組患者年齡、性別、高血壓比例、吸煙史、收縮壓、舒張壓、TC、TG、HDL-C、LDL-C、空腹血糖、血肌酐、hs-CRP等臨床基線資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。側(cè)支循環(huán)良好亞組有糖尿病史患者比例高于側(cè)支循環(huán)不良亞組（P＜0.05）。

表1 側(cè)支循環(huán)良好亞組與側(cè)支循環(huán)不良亞組患者臨床資料比較（±s）

表1 側(cè)支循環(huán)良好亞組與側(cè)支循環(huán)不良亞組患者臨床資料比較（±s）

注：TC：總膽固醇；TG：甘油三酯；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇； hs-CRP:超敏C-反應(yīng)蛋白。1 mmHg=0.133 kPa

項(xiàng)目側(cè)支循環(huán)不良亞組(n=47)側(cè)支循環(huán)良好亞組(n=42) P值年齡 (歲) 59.04±7.94 58.67±10.15 0.847男性[例 (%)]27 (57.4) 26 (61.9) 0.669高血壓[例 (%)]18 (38) 16 (38) 0.984糖尿病[例 (%)]10 (23) 18 (43) 0.029吸煙史[例 (%)]29 (62) 23 (55) 0.507收縮壓 (mmHg) 129.87±11.00 129.38±11.05 0.834舒張壓 (mmHg) 73.89±8.69 75.43±7.07 0.367 TC (mmol/L) 3.74±0.84 3.73±0.99 0.950 TG(mmol/L) 1.24±0.40 1.27±0.38 0.661 HDL-C(mmol/L) 1.30±0.33 1.38±0.42 0.349 LDL-C(mmol/L) 2.41±0.57 2.65±0.93 0.127空腹血糖(mmol/L) 5.61±1.20 5.85±1.46 0.404血肌酐 (μmol/L) 63.32±18.01 68.24±12.96 0.140 hs-CRP(mg/L) 4.03±2.00 3.99±2.12 0.923

2.2 各組患者血漿Jagged1蛋白與VEGF的表達(dá)水平（表2）

與正常對照組相比，冠心病組患者血漿Jagged1蛋白及VEGF水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）。側(cè)支循環(huán)良好亞組血漿Jagged1蛋白與VEGF水平顯著高于側(cè)支循環(huán)不良亞組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）。

表2 各組患者血漿Jagged1蛋白水平及VEGF水平的表達(dá)（±s）

表2 各組患者血漿Jagged1蛋白水平及VEGF水平的表達(dá)（±s）

注：VEGF：血管內(nèi)皮生長因子。與正常對照組比較*P＜0.01；與側(cè)支循環(huán)不良亞組比較△P＜0.01

組別例數(shù) Jagged1蛋白 (ng/L) VEGF (pg/L)正常對照組 30 23.04±8.97 72.73±14.55冠心病組 89 38.74±10.60* 113.98±30.80*側(cè)支循環(huán)不良亞組 47 31.56±6.26* 92.43±21.09*側(cè)支循環(huán)良好亞組 42 46.77±8.49*△ 128.10±20.24*△

2.3血漿Jagged1蛋白與VEGF的相關(guān)性分析

將血漿Jagged1蛋白與VEGF 進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：冠心病患者血漿Jagged1蛋白與VEGF 水平呈正相關(guān)（r=0.730，P＜0.01）。

多元回歸分析結(jié)果顯示（表3）：空腹血糖、VEGF、Jagged1蛋白是影響CCC形成的獨(dú)立預(yù)測因素。

表3 冠心病患者冠狀動脈側(cè)支循環(huán)與血漿Jagged1蛋白水平等因素的多元回歸分析結(jié)果

3 討論

CCC是人類心臟內(nèi)存在的一種天然旁路系統(tǒng)，它是由一些小動脈與其他小動脈相連形成的動脈網(wǎng)，正常情況下這些血管處于不成熟階段，不具備動脈血管的結(jié)構(gòu)和功能[7]。但當(dāng)冠狀動脈嚴(yán)重狹窄或閉塞時，這些血管在各種炎癥或生長因子的刺激下發(fā)展為成熟的動脈血管分支網(wǎng)絡(luò)，挽救瀕死心肌、改善心肌缺血和患者的預(yù)后[8，9]。良好的側(cè)支循環(huán)的建立對冠心病的發(fā)生和發(fā)展具有重要作用，但目前對于側(cè)支循環(huán)建立的具體機(jī)制尚不明確，因此探尋側(cè)支循環(huán)建立的機(jī)制對于改善冠心病患者預(yù)后具有重要的臨床意義。

Jagged1是存在于哺乳動物細(xì)胞膜上的一種單次跨膜蛋白，全長36 kb，是Notch受體的主要配體之一，廣泛表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞中的尖端細(xì)胞，在血管形成過程中起重要作用。大量研究表明，敲除Jagged1基因會引發(fā)小鼠胚胎和卵黃囊早期血管重塑缺陷，血管內(nèi)皮細(xì)胞不能形成良好的網(wǎng)狀環(huán)樣結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞遷移和細(xì)胞間相互連接的能力下降、血管發(fā)育異常、胚胎死亡[10，11]。最近一項(xiàng)研究通過采用成年雄性大鼠建立大腦中動脈栓塞后的腦缺血模型，發(fā)現(xiàn)梗死周圍區(qū)域Jagged1水平明顯升高，毛細(xì)血管網(wǎng)密度增加，腦皮質(zhì)周圍水腫明顯減輕，進(jìn)一步證實(shí)Jagged1在血管形成中的重要作用[12]。但Jagged1是否參與心肌缺血后CCC的建立目前國內(nèi)外尚未見有研究報道。本研結(jié)果發(fā)現(xiàn)冠心病組患者血漿Jagged1蛋白水平明顯高于正常對照組，且側(cè)支循環(huán)良好亞組Jagged1蛋白水平高于側(cè)支循環(huán)不良亞組，多元回歸分析結(jié)果顯示Jagged1蛋白是影響CCC形成的獨(dú)立預(yù)測因素。這些研究結(jié)果提示Jagged1可能參與CCC的形成，并且可能是預(yù)測冠狀動脈狹窄嚴(yán)重程度的一個重要指標(biāo)。

VEGF由內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生，是已知最強(qiáng)大的促血管生長因子，在心肌缺血、缺氧時參與CCC的形成，改善心肌的供血[13]。研究發(fā)現(xiàn)VEGF是Dll4/Notch信號的下游基因，Cristofaro等[14]通過采用Dll4+/-小鼠制造大腦中動脈閉塞模型結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Dll4/ Notch信號通路在血管發(fā)生過程中通過調(diào)節(jié)VEGF受體的表達(dá)并降低其反應(yīng)性，限制腦血管側(cè)支循環(huán)形成。而Jagged1與Dll4在血管形成過程中作用相反，通過下調(diào)Dll4/ Notch信號傳導(dǎo)，提高尖端細(xì)胞的數(shù)量及活性調(diào)節(jié) VEGF的分泌，進(jìn)而促進(jìn)新生血管形成[15]。Jagged1與Dll4在血管形成方面的影響不同是因?yàn)樗鼈兗せ盍瞬煌腘otch受體。近年來，Jagged1/Notch信號在血管形成中的作用逐漸受到重視。Kwon 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Jagged1/Notch信號通路可通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能促進(jìn)新生血管形成，也可通過直接傳遞Jagged1/Notch信號通路調(diào)節(jié)VEGF3的分泌來促進(jìn)血管新生[17]。本研究為了觀察Jagged1與VEGF在CCC形成過程中是否相關(guān)，我們檢測Jagged1蛋白水平的同時也檢測了VEGF水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)冠心病患者血漿VEGF水平較正常對照組明顯升高，側(cè)支循環(huán)良好組VEGF水平較側(cè)支循環(huán)不良組顯著升高，更重要的是冠心病患者血漿Jagged1蛋白與VEGF 水平呈顯著正相關(guān)，因此我們推測Jagged1可能通過介導(dǎo)Jagged1/Notch信號通路調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)，從而促進(jìn)新生血管形成，參與CCC的建立。雖然有關(guān)Jagged1在CCC形成過程中的機(jī)制尚不清楚，但隨著研究的深入，Jagged1作為冠心病新的研究方向?qū)⒕哂袕V闊的應(yīng)用前景。

綜上所述，Jagged1與冠心病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，并且側(cè)支循環(huán)良好亞組與側(cè)支循環(huán)不良亞之間血漿Jagged1蛋白水平有顯著差異，同時冠心病患者血漿Jagged1蛋白與VEGF呈正相關(guān)。這一結(jié)果表明，Jagged1蛋白可能通過調(diào)節(jié)血管生成參與CCC的建立。由于本研究樣本量較小，其確切機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1]Meier P, Lansky AJ, Fahy M, et al. The impact of the coronary collateral circulation on outcomes in patients with acute coronary syndromes: results from the ACUITY trial[J]. Heart, 2014, 100(8):647-651. DOI: 10. 1136/heartjnl-2013-304435.

[2]Choi JH, Chang SA, Choi JO, et al. Frequency of myocardial infarction and its relationship to angiographic collateral flow in territories supplied by chronically occluded coronary arteries[J]. Circulation,2013, 127(6): 703-709. DOI: 10. 1161/CIRCULATIONAHA. 112.092353.

[3]晉金蘭, 韋建瑞. Notch 信號和核因子-κB信號通路與心肌梗死后心室重構(gòu)之間關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 中國循環(huán)雜志, 2015, 30(7):718-720. DOI: 10. 3969/j. issn. 1000-3614. 2015. 07. 026.

[4]Meier P, Schirmer SH, Lansky AJ, et al. The collateral circulation ofthe heart[J]. BMC Medicine, 2013, 11: 143. DOI: 10. 1186/1741-7015-11-143.

[5]Sainson RCA, Johnston DA, Chu HC, et al. TNF primes endothelial cells for angiogenic sprouting by inducing a tip cell phenotype[J]. Blood, 2008,111(10): 4997-5007. DOI: 10. 1182/blood-2007-08-108597.

[6]Ii M, Takeshita K, Ibusuki K, et al. Notch signaling regulates endothelial progenitor cell activity during recovery from arterial injury in hypercholesterolemic mice[J]. Circulation, 2010, 121(9): 1104-1112. DOI: 10. 1161/CIRCULATIONAHA. 105. 553917.

[7]Chalothorn D, Faber JE. Formation and maturation of the native cerebral collateral circulation[J]. Mol Cell Cardiol, 2010, 49(2): 251-259. DOI: 10. 1016/j. yjmcc. 2010. 03. 014.

[8]Meier P, Hemingway H, Lansky AJ, et al. The impact of the coronary collateral circulation on mortality: a meta-analysis [J]. Eur Heart J,2012, 33(5): 614-621. DOI: 10. 1093/eurheartj/ehr308.

[9]趙慧強(qiáng), 陳暉, 李東寶, 等. 心肌梗死后冠狀動脈側(cè)支循環(huán)發(fā)展進(jìn)程[J]. 中國循環(huán)雜志, 2012 , 27(4): 266-269. DOI: 10. 3969/j. issn.1000-3614. 2012. 04. 007.

[10]Roca C, Adams RH. Regulation of vascular morphogenesis by Notch signaling[J]. Genes Dev, 2007, 21(20): 2511-2524. DOI: 10. 1101/gad.1589207.

[11]Birukova AA, Birukov KG, Adyshev D, et al. Involvement of microtubules and Rho pathway in TGF-β1-induced lung vascular barrier dysfunction[J]. J Cell Physiol, 2005, 204(3): 934-947. DOI: 10.1002/jcp. 20359.

[12]Nardai S, Dobolyi A, Pál G, et al. Selegiline promotes NOTCHJAGGED signaling in astrocytes of the peri-infarct region and improves the functional integrity of the neurovascular unit in a rat model of focal ischemia[J]. Restor Neurol Neuros, 2015, 33: 1-14.DOI: 10. 3233/RNN-140420.

[13]Lucitti JL, Mackey JK, Morrison JC, et al. Formation of the collateral circulation is tegulated by vascular endothelial growth factor-A and a disintegrin and metalloprotease family members 10 and 17 novelty and significance[J]. Circ Res, 2012, 111: 1539-1550. DOI: 10. 1161/CIRCRESAHA. 112. 279109.

[14]Cristofaro B, Shi Y, Faria M, et al. Dll4-Notch signaling determines the formation of native arterial collateral networks and arterial function in mouse ischemia models[J]. Development, 2013, 140: 1720-1729.DOI: 10. 1242/dev. 092304.

[15]Pedrosa AR, Trindade A, Fernandes AC, et al. Endothelial Jagged1 antagonizes Dll4 regulation of endothelial branching and promotes vascular maturation downstream of Dll4/Notch1[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2015, 35 (5): 1134-1146. DOI: 10. 1161/ATVBAHA. 114.304741.

[16]Kwon SM, Eguchi M, Wada M, et al. Specific Jagged-1 signal from bone marrow microenvironment is required for endothelial progenitor cell development for neovascularization [J]. Circulation, 2008, 118(2):157-165. DOI: 10. 1161/CIRCULATIONAHA. 107. 754978.

[17]Pedrosa AR, Trindade A, Carvalho C, et al. Endothelial Jagged1 promotes solid tumor growth through both pro-angiogenic and angiocrine functions[J]. Oncotarget, 2015, 6(27): 24404. DOI: 10.18632/oncotarget. 4380.