楊航宇，楊哲，何非，陳為凱，王軍*

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院/農(nóng)業(yè)部葡萄酒加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

葡萄是葡萄科（Vitaceae）葡萄屬（Vitis）落葉藤本植物，是世界第二大水果[1]，可用于釀酒、鮮食、制汁和制干，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。葡萄種質(zhì)資源繁多，且容易發(fā)生芽變，所以在引種和栽培過程中常發(fā)生同名異物或同物異名現(xiàn)象，給葡萄的選育和推廣帶來很多不便。傳統(tǒng)的利用形態(tài)學(xué)特征或利用花色苷等酚類物質(zhì)組成和含量作為化學(xué)指紋的鑒別方法[2-4]，由于容易受環(huán)境、氣候影響，不能有效區(qū)分葡萄的無性系等，在品種鑒別時(shí)會(huì)受到限制。近年來，隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，SSR（Simple Sequence Repeat，簡單序列重復(fù)）標(biāo)記技術(shù)以其多態(tài)性高、符合孟德爾共顯性遺傳、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[5]，被廣泛應(yīng)用于葡萄的品種鑒定、遺傳多樣性研究和親緣關(guān)系分析。比如，Díaz Losada等[6]利用SSR標(biāo)記對(duì)生長在西班牙的葡萄品種進(jìn)行鑒別，發(fā)現(xiàn)了某些品種的同物異名現(xiàn)象；尹玲等[7]利用SSR標(biāo)記建立了近年來我國新育成的24個(gè)葡萄品種的指紋圖譜，并明確了它們的親緣關(guān)系；DNA分子標(biāo)記還可以作為鑒定品種的附加描述符，與形態(tài)學(xué)標(biāo)記相結(jié)合來對(duì)葡萄種質(zhì)資源進(jìn)行描述[8-9]，如Bosco等[8]在葉片形態(tài)和SSR標(biāo)記兩個(gè)方面對(duì)西班牙西北部的9個(gè)葡萄品種進(jìn)行了描述和區(qū)分。

本研究選取了國內(nèi)外常見的和近年來我國選育的43個(gè)用于釀酒或鮮食的葡萄品種，利用6對(duì)SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)上述葡萄品種的遺傳多樣性進(jìn)行分析，通過建立DNA指紋圖譜進(jìn)行品種鑒別，并在分子水平上探究了各葡萄種質(zhì)的親緣關(guān)系，以期為葡萄種質(zhì)資源的鑒別、管理和推廣提供理論依據(jù)和參考價(jià)值。

表1 43份供試葡萄種質(zhì)資源Table 1 43 grape germplasms resource in this research

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料名稱及起源地見表1。43個(gè)栽培葡萄品種，其中瓊瑤漿采自新西蘭種質(zhì)資源圃，引進(jìn)冬季休眠枝條，回國解除休眠，扦插成活；其余42份葡萄種質(zhì)采自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實(shí)驗(yàn)站（北京，40.14°N，116.19°E）。采樣時(shí)每個(gè)品種選擇2～3片生長良好的幼葉裝入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，液氮速凍后放-80 ℃冰箱保存，用于基因組DNA的提取。

1.2 DNA提取

采用王軍等[10]改良的CTA B法提取葡萄幼葉中的基因組DNA，以λDNA（48 kb，50 ng/μL，天根生化科技有限公司）為標(biāo)準(zhǔn)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA溶液的質(zhì)量，并以λDNA亮度為標(biāo)準(zhǔn)，選擇適當(dāng)比例將提取的基因組DNA稀釋至50 ng/μL，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA擴(kuò)增和電泳

選用6對(duì)VIVC葡萄種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫提供的引物用于葡萄品種的SSR擴(kuò)增，這6對(duì)引物被This等[11]推薦為用于葡萄品種的核心標(biāo)記，引物由上海生工公司合成，序列及退火溫度見表2。采用如下比例的20 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：2 μL 10×PCR buffer，1.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，1U TaqDNA聚合酶，50 ng模板DNA，0.4 μmol/L引物（每條）。體系中反應(yīng)物均購自寶生物工程（大連）有限公司。

表2 6對(duì)SSR引物信息[11]Table 2 Information of six pairs of SSR primers

實(shí)驗(yàn)在Prime G02型PCR儀（英國Bibby Scientific公司）中進(jìn)行。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離檢驗(yàn)。對(duì)正向引物5'端加FAM熒光標(biāo)記，重新合成熒光引物，重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳，ABI3730xI全自動(dòng)分析儀進(jìn)行片段收集，利用GenemapperV3.2進(jìn)行條帶分析，確定每個(gè)等位基因的片段大小。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用popgene 32軟件對(duì)6對(duì)引物擴(kuò)增的等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、Shannon多樣性指數(shù)（I）及多態(tài)性位點(diǎn)百分比等進(jìn)行計(jì)算；利用NTSYSpc Version 2.10e軟件計(jì)算成對(duì)種質(zhì)間Jaccord（J）遺傳相似系數(shù)，并根據(jù)遺傳相似系數(shù)，利用MEGA 5.1軟件，采用非加權(quán)平均法（UPGMA）對(duì)供試材料進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性分析

6對(duì)SSR引物對(duì)43份葡萄種質(zhì)的擴(kuò)增結(jié)果見表3。由表3可以看出，在43份葡萄品種中共擴(kuò)增出64個(gè)等位基因，片段大小為123～269 bp，其中每個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增出的等位基因數(shù)為8～13個(gè)，平均等位基因數(shù)為10.67，平均有效等位基因6.20個(gè)。

各引物的觀測雜合度（Ho）為0.74～0.84，平均Ho為0.80；期望雜合度（He）為0.82～0.88，平均He為0.84。Shannon多樣性指數(shù)（I）為1.86～2.22，平均I為2.01。其中，Ho（觀測到雜和個(gè)體數(shù)/樣本個(gè)體數(shù)總數(shù)）能夠反應(yīng)實(shí)際群體中某一位點(diǎn)雜合子所占比例，雜合度越高，該位點(diǎn)處的基因型越多，遺傳變異越豐富[12]。在6對(duì)引物中，VVMD7，VRZAG62和VRZAG79的Ho在0.8以上，擴(kuò)增出豐富的基因型，顯示出了良好的多態(tài)性。

所有引物的多態(tài)性條帶比例均為100%，表明所選引物遺傳多態(tài)性高，進(jìn)而表明了不同葡萄品種之間的遺傳差異。此外，6對(duì)引物均擴(kuò)增出了特征性條帶，這將對(duì)葡萄品種鑒定具有貢獻(xiàn)。

表3 6對(duì)SSR引物的遺傳多態(tài)性指標(biāo)Table 3 Genetic parameters of 6 SSR loci

2.2 DNA指紋數(shù)據(jù)及圖譜的建立

PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳分離并進(jìn)行條帶分析，可得到擴(kuò)增片段的大小，整理得到6對(duì)SSR引物對(duì)43份葡萄種質(zhì)擴(kuò)增的DNA指紋數(shù)據(jù)（表4）。

根據(jù)各個(gè)品種在不同位點(diǎn)的指紋數(shù)據(jù)，并與VIVC標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫（http://www.vivc.de）比對(duì)，可以進(jìn)行品種的鑒別。由表4可以看出，除了21個(gè)品種的指紋信息VIVC標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫中未收錄之外，其余22個(gè)品種的指紋信息均與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫一致，可以實(shí)現(xiàn)品種的鑒定。

對(duì)擴(kuò)增出的等位基因按順序排列，按照各品種中每個(gè)等位基因的有無賦予“1, 0”兩個(gè)數(shù)值，由此可以得到二元數(shù)據(jù)矩陣，根據(jù)二元數(shù)據(jù)矩陣構(gòu)建43份供試葡萄種質(zhì)的分子指紋圖譜，結(jié)果如圖1所示。綜合6個(gè)位點(diǎn)的SSR數(shù)據(jù)可知，43個(gè)品種的指紋圖譜各不相同，這表明可以利用SSR擴(kuò)增得到的指紋數(shù)據(jù)進(jìn)行品種鑒別，同時(shí)也說明了供試的樣品中不存在同物異名的現(xiàn)象。

2.3 親緣關(guān)系分析

由6對(duì)SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果，利用NTSYSpc Version 2.10e軟件，根據(jù)各品種之間的相似系數(shù)，采用非加權(quán)平均法（UPGMA）對(duì)所有品種進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖2所示。6對(duì)SSR引物標(biāo)記可以將43個(gè)葡萄品種完全分開，它們的遺傳相似系數(shù)在0.13～0.75，在0.13處，全部供試品種可以被劃分為3大類。

第一大類（A組）包含17個(gè)品種，其中在遺傳相似系數(shù)0.19處又可被細(xì)分為兩個(gè)組：第一組（A1）包括‘赤霞珠’‘長相思’‘小芒森’‘瓊瑤漿’‘美樂’‘貴人香’‘西拉’‘維歐尼’‘胡?！鸂枴∥秲憾唷つ取R爾貝克’和‘寶石無核’，其中‘長相思’是‘赤霞珠’的親本之一，二者被聚到了一起；第二組（A2）：包括‘雷司令’‘霞多麗’和‘煙73’，3個(gè)品種均為釀酒品種。

第二大類（B組）包含22個(gè)品種，在遺傳相似系數(shù)0.21處可以被進(jìn)一步的分為3個(gè)組：第一組（B1）包括‘馬瑟蘭’‘阿拉奈爾’‘Kolor’‘北冰紅’‘麗紅寶’‘無核白雞心’‘無核翠寶’‘Fresno’和‘克瑞森無核’等9個(gè)品種，其中‘馬瑟蘭’和‘阿拉奈爾’起源于法國，‘麗紅寶’和‘無核翠寶’與其共同親本‘無核白雞心’聚為一類；第二組（B2）包括‘玫瑰香’‘魏可’‘奧古斯特’‘維多利亞’‘愛神玫瑰’‘碧香無核’‘夏至紅’‘瑞都無核怡’‘金田皇家無核’‘瑞都香玉’‘瑞都翠霞’‘沈農(nóng)金皇后’12個(gè)品種，這12個(gè)品種均為鮮食品種，其中8個(gè)品種為我國選育的品種；第三組（B3）是‘秋紅寶’。

第三大類（C組）：包括‘希姆勞特’‘白香蕉’‘Neptune’和‘Jupiter’4個(gè)品種，全部為歐美雜種，且起源地均為美國。

3 討論

3.1 DNA指紋數(shù)據(jù)建立和品種鑒別

根據(jù)每個(gè)引物擴(kuò)增片段的大小，整理可以得到基于

6對(duì)SSR引物對(duì)43份葡萄種質(zhì)擴(kuò)增的DNA指紋數(shù)據(jù)。在葡萄引種和種質(zhì)資源推廣時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)同物異名或同名異物等現(xiàn)象，相較于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定，SSR標(biāo)記可以提高鑒別的準(zhǔn)確性，如Vilanova等[17]利用SSR對(duì)25種生長在西班牙的葡萄品種進(jìn)行鑒別，并對(duì)其中同名異物的品種進(jìn)行了區(qū)分；利用不同引物擴(kuò)增出來的片段大小的不同，可以實(shí)現(xiàn)品種區(qū)分，如杜晶晶[13]和王慧玲[14]等通過對(duì)各引物擴(kuò)增的等位基因數(shù)進(jìn)行賦值，構(gòu)建葡萄種質(zhì)的分子身份證對(duì)品種進(jìn)行區(qū)分；除了分子身份證之外，還可以將DNA指紋數(shù)據(jù)按照各條帶的有無轉(zhuǎn)化成二元數(shù)據(jù)矩陣，但相關(guān)內(nèi)容研究結(jié)果呈現(xiàn)主要是以“0, 1”或“+,-”的形式[15-16]，本研究在二元數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步構(gòu)建了基于SSR標(biāo)記的指紋圖譜，更加簡單明了的實(shí)現(xiàn)了品種的區(qū)分。本研究結(jié)果顯示，43個(gè)品種的指紋圖譜各不相同，進(jìn)一步表明了SSR指紋數(shù)據(jù)可以應(yīng)用于對(duì)引種時(shí)錯(cuò)誤命名情況的鑒別和糾正。

表4 43個(gè)葡萄品種在6個(gè)SSR位點(diǎn)的DNA指紋數(shù)據(jù)Table 4 DNA pro?le data of 43 cultivars at six SSR loci

圖1 基于SSR標(biāo)記構(gòu)建的43份葡萄種質(zhì)指紋圖譜Figure 1 Molecular ?ngerprint of 43 grape cultivars based on SSR markers

除了對(duì)品種進(jìn)行區(qū)分外，整理得到的DNA指紋數(shù)據(jù)，可以與VIVC標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，本試驗(yàn)所研究的43個(gè)葡萄品種中，除未收錄的品種外，22個(gè)品種的指紋數(shù)據(jù)均與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫一致，表明利用SSR擴(kuò)增得到的指紋數(shù)據(jù)可以對(duì)品種進(jìn)行鑒定。

3.2 親緣關(guān)系分析

本研究利用6對(duì)SSR引物擴(kuò)增的數(shù)據(jù)，根據(jù)各品種之間的相似系數(shù)，采用非加權(quán)平均法對(duì)所有品種進(jìn)行聚類，并對(duì)這43份鮮食與釀酒葡萄種質(zhì)進(jìn)行了親緣關(guān)系分析。

從用途方面來看，通過聚類基本上可以將釀酒葡萄與鮮食葡萄區(qū)分開，如A組中除‘胡?！▋捎茫┖汀畬毷療o核’（鮮食）外，其余均為釀酒品種，而B、C兩組中除‘玫瑰香’（兩用）和‘北冰紅’（釀酒）外，其余均為鮮食品種，這可能與性狀連鎖有關(guān)，即本文研究的6個(gè)SSR位點(diǎn)可能與某些決定葡萄果實(shí)品質(zhì)的基因連鎖，釀酒葡萄與鮮食葡萄由于果實(shí)大小、糖酸含量等性狀的不同，可以被區(qū)分開來，如Leocirj等[18]利用SSR分子標(biāo)記對(duì)歐亞種葡萄中與葉片形態(tài)有關(guān)的位點(diǎn)進(jìn)行了定位；牛早柱[19]分析了葡萄果實(shí)中的糖、酸和香氣物質(zhì)，并把這些表型性狀與SSR分子標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析研究，找出了與上述物質(zhì)合成顯著相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)。本試驗(yàn)中可能也是由于調(diào)控某些性狀的基因與SSR位點(diǎn)連鎖，從而將釀酒品種與鮮食品種區(qū)分開，這有待于進(jìn)一步的研究。

從地理起源方面來看，A組的各個(gè)品種大多數(shù)起源于法國和德國，B組中大多是近年來我國育成的品種，其中也有少部分起源于歐洲國家的品種，由于親緣關(guān)系相近而與我國選育的品種聚在一起，C組中則是起源于美國的品種，且均為歐美雜種。葡萄種群的形成與其起源地的地理及氣候特征有密切的聯(lián)系，前人[20-21]常利用花色苷或酚類物質(zhì)的組成和含量作為化學(xué)指紋，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析對(duì)葡萄或葡萄酒的產(chǎn)地進(jìn)行區(qū)分；Martínez等[22]利用SSR標(biāo)記對(duì)葡萄品種進(jìn)行聚類時(shí)發(fā)現(xiàn)聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)形狀有關(guān)，但未與產(chǎn)地形成關(guān)聯(lián)，因而未能區(qū)分秘魯和阿根廷的品種。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，利用SSR標(biāo)記可以較好的實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄起源地的區(qū)分，這啟示我們可以將DNA指紋和化學(xué)指紋綜合起來運(yùn)用于葡萄起源地和產(chǎn)地的分析。此外，本研究中供試的釀酒葡萄大多起源于歐洲（法國、德國等），鮮食葡萄大多起源于亞洲東部（中國、日本等），所以本文中所論述的鮮食葡萄與釀酒葡萄被區(qū)分開，可能是起源地的差異和性狀連鎖綜合作用的結(jié)果。

圖2 基于SSR標(biāo)記的43份葡萄種質(zhì)聚類分析圖Figure 2 Dendrogram of 43 grape cultivars based on SSR markers

從親本關(guān)系方面來看，如前文所述，本研究發(fā)現(xiàn)多對(duì)子代與其親本或擁有共同親本的品種聚為一類的現(xiàn)象，這表明了SSR標(biāo)記在親緣關(guān)系分析中的作用。有些葡萄品種由于栽培歷史悠久或栽培品種之間進(jìn)行雜交和自交等，導(dǎo)致其親緣關(guān)系不明確，SSR標(biāo)記是一種研究親緣關(guān)系的好方法，對(duì)SSR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，可以研究品種之間的親緣關(guān)系以及尋找子代的親本[23-24]，如尹玲等[7]利用6對(duì)SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果，結(jié)合聚類分析確定了我國育成的品種昌黎21號(hào)的親本為‘巨峰’ב早黑寶’，而不是此前認(rèn)為的‘巨峰’ב玫瑰香’。此外，本研究中4個(gè)歐美雜種（C組）與歐亞種葡萄（A、B組）明顯區(qū)分開，與李雪雁等[25]研究結(jié)果一致，說明我國葡萄種質(zhì)資源中的歐亞種和歐美雜種存在明顯區(qū)別。

4 結(jié)論

SSR標(biāo)記是葡萄種質(zhì)資源鑒定的有效方法，本文以43個(gè)釀酒和鮮食品種為研究對(duì)象，利用6對(duì)SSR引物對(duì)上述品種進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行多態(tài)性分析，通過建立DNA指紋圖譜對(duì)品種進(jìn)行區(qū)分和鑒別，之后對(duì)所有品種進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明：根據(jù)建立的DNA指紋數(shù)據(jù)，可以區(qū)分供試的葡萄品種，并可以通過與VIVC標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫比對(duì)實(shí)現(xiàn)品種鑒定；通過聚類分析基本上可以從用途和起源地兩方面實(shí)現(xiàn)對(duì)各種質(zhì)的區(qū)分，并可以有效的分析各種質(zhì)之間的親緣關(guān)系。本研究從分子水平上為葡萄種質(zhì)資源的鑒別、遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析提供了參考價(jià)值。

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