馬慧敏 趙 琦 劉 瑋

IFI16(interferon inducible protein 16)是干擾素誘導(dǎo)核蛋白。IFI16最初被發(fā)現(xiàn)于淋巴細(xì)胞核內(nèi)，后經(jīng)免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，IFI16廣泛表達(dá)于不同組織中[1]，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等[2]。Hensler等證實(shí)IFI16基因包含在細(xì)胞老化中起作用的基因[3]。2010年，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)IFI16可以抑制細(xì)胞生長，誘導(dǎo)細(xì)胞老化，并下調(diào)hTERT的表達(dá)[4,5]，由此將干擾素誘導(dǎo)蛋白引入到衰老研究領(lǐng)域。

IF116調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期[6]，在老化成纖維細(xì)胞中IFI16 mRNA和蛋白水平高于年輕細(xì)胞[7]；在正常人前列腺細(xì)胞，細(xì)胞老化后IFI16表達(dá)水平升高；永生化的成纖維細(xì)胞中IFI16表達(dá)降低，過度表達(dá)IFI16可以明顯地抑制細(xì)胞增殖[8]。在鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞、睪丸癌及人前列腺癌中IFI16表達(dá)下調(diào)[9-11]。以上的研究結(jié)果表明細(xì)胞老化的生物學(xué)過程中IFI16表達(dá)增高且在該過程中發(fā)揮重要作用。

β-半乳糖苷酶活性升高是典型的復(fù)制老化的生物學(xué)標(biāo)志[12]，細(xì)胞生長停滯是細(xì)胞老化的另一特征。實(shí)驗(yàn)中，以人成纖維細(xì)胞為研究對象，使用UVB重復(fù)照射細(xì)胞，檢測β-半乳糖苷酶及細(xì)胞周期，以確定細(xì)胞老化模型建立，進(jìn)而檢測IFI16 mRNA及蛋白水平變化，以明確IFI16在細(xì)胞光老化過程中其表達(dá)是否變化。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 DMEM高糖培養(yǎng)液(德國，PAA)，胎牛血清(北京元享圣馬生物技術(shù)有限公司)，雙抗(100 U/mL青霉素及100 ug/ml鏈霉素)，UVB照射裝置(sigma),UVB輻照計(jì)(北京師范大學(xué)光電儀器廠)，CCK-8試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，酶聯(lián)免疫檢測儀(美國BIO-RAD)，trizol(invitrogen),cDNA合成試劑盒(北京天根)，real time PCR mix(北京天根)，IFI16單克隆抗體(abcam)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與UVB照射 常規(guī)分離培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞。取5～10代以內(nèi)成纖維細(xì)胞，按10000個/cm2細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿中，UVB照射細(xì)胞時，將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液換成PBS,照射完畢后換回培養(yǎng)液。UVB照射劑量為：100、200、 300、400 及 500 mJ/cm2，對照組除不接受UVB照射外，其他處理同UVB照射組細(xì)胞。

為了更加準(zhǔn)確地模擬光老化的過程，根據(jù)UVB對成纖維細(xì)胞活性影響的試驗(yàn)結(jié)果選擇小劑量重復(fù)照射方式，以300 mJ/cm2作為照射總劑量，每次100 mJ/cm2，共三次照射。

1.3 細(xì)胞增殖率測定 用WST-8分析細(xì)胞活性。UVB照射后24 h，用含10% WST-8溶液的新鮮培養(yǎng)液孵育細(xì)胞2 h后，用酶標(biāo)儀于450 nm處測定OD值。

1.4 原位β-半乳糖苷酶染色分析 根據(jù)試劑使用說明，用2%甲醛和0.2%戊二醛固定細(xì)胞后，PBS沖洗2遍，按說明配制X-gal溶液，于37℃孵育24 h后，觀察三個視野，每個視野至少計(jì)數(shù)100個細(xì)胞，并計(jì)算染色細(xì)胞陽性率。

1.5 細(xì)胞周期分析 根據(jù)試劑盒(Cycletest plus, BecTon Dickinson, USA)說明行細(xì)胞周期分析。收集細(xì)胞，用70%酒精于4℃固定過夜后，離心用PBS清洗2次，依次加入A和B溶液于室溫下孵育10 min，最后用C溶液于冰上染色10 min；過濾后，上機(jī)檢測。

1.6 RNA提取及實(shí)驗(yàn)定量PCR 用Trizol提取細(xì)胞總RNA，取0.5 ug RNA為模板合成cDNA；用1 ul cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參并設(shè)陰性對照，每個樣本設(shè)三個重復(fù)。反應(yīng)條件為：95℃，15 min，熱激活；95℃ 15 s 變性，65℃ 1 min退火和延伸，共40個循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束時，做熔解曲線。用“△△CT方法”分析表達(dá)水平。

IFI16及β-actin引物如下：IFI16 forward (5′-ACTGAGTACAACAAAGCCATTTGA-3′), IFI16 reverse (5′-TTGTGACATTGTCCTGTCCCCAC-3′)， β-actin forward (5′-GTTGCTATCCAGGCTGTG-3′), β-actin reverse (5′-TGTCCACGTCACACTTCA-3′)。

1.7 Western分析 用RIPA裂解細(xì)胞提取蛋白并用BCA做蛋白定量，10% SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，二抗室濕孵育1 h，ECL發(fā)光，壓片，分析各條帶的灰度，將目的條帶的灰度值與內(nèi)參的灰度值的比值作為目的蛋白的表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 結(jié)果用mean±S.D.方式表示。根據(jù)需要采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析不同處理組之間的差異，P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 UVB細(xì)胞毒性分析 UVB照射后，在照射劑量為300 mJ/cm2時，細(xì)胞活性輕度下降,與對照組無顯著差異(P>0.05)；當(dāng)劑量達(dá)到400 mJ/cm2和500 mJ/cm2時，細(xì)胞活性下降顯著(*P<0.0001)(表1，圖1)。

2.2 UVB照射后老化相關(guān)β-半乳糖苷酶染色分析 在本研究中，UVB照射后，β-半乳糖苷酶染色陽性率由11%上升為84% (圖2)。

2.3 UVB照射后細(xì)胞周期分析 UVB照射后，處于G2/M期的細(xì)胞比例由9.29%上升到31.16%，與對照組相比，有顯著性差異(P<0.05)(圖3)。

2.4 UVB照射細(xì)胞后，IFI16表達(dá)水平升高 UVB照射后，IFI16 mRNA和蛋白表達(dá)水平均上升，分別為2.11±0.45倍和1.59±0.23倍，且升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見圖4、5。

表1 紫外線對細(xì)胞增殖活性的影響

圖1 UVB照射后細(xì)胞毒性分析：UVB處理劑量由0～500 mJ/cm2。(*,與對照組相比p<0.05)圖2 三次小劑量UVB(100 mJ/cm2)重復(fù)照射后β-gal活性分析：(2a)對照組(β-gal染色,×200)，(2b)UVB處理組細(xì)胞(β-gal染色,×200)

圖3 三次小劑量UVB(100 mJ/cm2)重復(fù)照射后細(xì)胞周期分析：(a)對照組細(xì)胞周期分布；(b)UVB處理組細(xì)胞周期分布；(c)細(xì)胞周期百分比條圖；(d)兩組細(xì)胞處于細(xì)胞周期G2/M期百分比分析(*,與對照組相比P<0.05)

圖4 三次小劑量UVB(100 mJ/cm2)重復(fù)照射后，IFI16 mRNA表達(dá)水平的變化(*P<0.05)圖5 a、b三次小劑量UVB(100 mJ/cm2)重復(fù)照射后，IFI16蛋白表達(dá)水平變化

3 討論

目前，光老化機(jī)制的研究是學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)問題，對該問題的研究可以預(yù)防紫外線引起的損害。為了研究這一機(jī)制，細(xì)胞光老化模型的建立是尤為關(guān)鍵的步驟。

首先，根據(jù)UVB對成纖維細(xì)胞的光毒性作用，選擇小劑量重復(fù)照射的方式作用于成纖維細(xì)胞。有研究認(rèn)為，當(dāng)β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞比例達(dá)到55%時，細(xì)胞即進(jìn)入老化階段[13]。在本研究中，β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)到84%，因此，符合細(xì)胞老化的標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞周期停滯是老化細(xì)胞的另一特征。UVB照射后，細(xì)胞周期停滯于G2/M期，這與以前的研究相一致，即老化細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯于G2/M[14]期。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，UVB小劑量重復(fù)照射的方式可以在短時間內(nèi)建立穩(wěn)定的細(xì)胞老化模型。

在近期研究中，證實(shí)IFI16參與自然老化過程，在該過程中，IFI16表達(dá)升高，且轉(zhuǎn)錄性調(diào)節(jié)P53及端粒酶而介導(dǎo)細(xì)胞老化過程[15，16]。在本研究中，UVB照射后誘導(dǎo)細(xì)胞老化，在該老化細(xì)胞中，IFI16 mRNA及蛋白表達(dá)均升高。但是，在細(xì)胞光老化過程中，IFI16表達(dá)升高能否調(diào)節(jié)P53及端粒酶，并進(jìn)而影響細(xì)胞光老化進(jìn)程中的生物學(xué)行為，仍然需要進(jìn)一步研究。

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