丁紅巖 高金瑜# 張燕 李長(zhǎng)華 孫廣琴

（1南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安一院 江蘇淮安223300；2山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 濟(jì)南250021）

卵巢癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤之一，其死亡率居?jì)D科惡性腫瘤第1位。抑癌基因的失活是卵巢癌發(fā)生及發(fā)展的關(guān)鍵因素，其主要表現(xiàn)有基因突變、缺失以及啟動(dòng)子區(qū)域（CPG島）的過甲基化。p14是細(xì)胞周期調(diào)控因子，通過MDM2-p53通路履行調(diào)控細(xì)胞進(jìn)程的職責(zé)。上皮性卵巢癌中的表達(dá)異常是否由p14基因啟動(dòng)子的甲基化所致，尚未見報(bào)道。本文旨在探討p14基因啟動(dòng)子甲基化在上皮性卵巢癌中的存在情況，同時(shí)檢測(cè)p14基因的突變情況，觀察其與p14甲基化的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2007年9月～2009年6月我院收治的45例上皮性卵巢癌患者、30例卵巢良性腫瘤患者及20例卵巢組織正常者作為研究對(duì)象，所有患者的病理診斷及組織分級(jí)明確，術(shù)前均未進(jìn)行任何化療或放療等治療。上皮性卵巢癌患者中，根據(jù)細(xì)胞分化程度有14例高分化癌，18例中分化癌，13例低分化癌；平均年齡（45.5±6.2）歲；25例漿液性囊腺癌，13例黏液性囊腺癌，6例子宮內(nèi)膜樣癌，1例透明細(xì)胞癌。卵巢良性腫瘤患者中，有17例漿液性囊腺瘤，13例黏液性囊腺瘤；平均年齡（44.9±5.1）歲。卵巢組織正?；颊呔鶠閷m頸良性病變者，患者平均年齡（46.7±5.2）歲。三組患者的一般資料相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05，具有可比性。所有手術(shù)標(biāo)本的采集均已得到患者的同意并簽署知情同意書，標(biāo)本切除后立即－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 甲基化特異性PCR檢測(cè)

1.2.1 組織DNA提取 組織DNA的提取采用酚-氯仿-異戊醇法，之后通過紫外分光光度法進(jìn)行組織DNA濃度及純度的檢測(cè)。

1.2.2 DNA修飾及純化 取 2 μg DNA、3 mol/L NaOH 5 μl加入到50 μl療效反應(yīng)體系中，充分混勻后于75℃反應(yīng)15 min，隨后加入4.8 mol/L亞硫酸氫鈉（購(gòu)自Sigma公司）320 μl和20 mmol/L的氫醌12.6 μl，充分混勻后再加入 10 μl礦物油，于 55 ℃中水浴過夜。另外，將1 ml DNA純化樹脂（購(gòu)自Promega公司）加入到每個(gè)DNA樣本中，通過純化柱，再加入80%異丙醇溶解樹脂2 ml、NaOH脫硫3 mol/L 5 μl、醋酸鈉 5 mol/L 5 μl，用 100%冰乙醇進(jìn)行DNA沉淀，75%乙醇吹洗，離心，棄上清液，隨后溶于30 μl TE緩沖液中進(jìn)行備用。

1.2.3 甲基化特異PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系共25 μl，主要有 DNA 2 μl、10×PCR buffer 2.5 μl、引物 0.5 μl、dNT 2 μl，Taq 酶 0.2 μl，雙蒸水補(bǔ)足至 25 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃反應(yīng)30 s，57℃退火 45 s，72℃反應(yīng) 30 s，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸 10 min。注意非甲基化反應(yīng)退火溫度為54℃。以甲基轉(zhuǎn)移酶SssI處理和未處理的正常人外周血細(xì)胞DNA為陽性和陰性對(duì)照，空白對(duì)照采用雙蒸水。甲基化引物序列：上游引物F5'-GGT ATA TTT TCG AGG GGT ACG-3'，R5'-TTC CCG ACC CGC ACT CCG C-3'，預(yù)期產(chǎn)物為90 bp；非甲基化引物序列如下：F5'-TGT GAG GGT ATA TTT TTG AGG GGT AT-3'，R5'-CTT CTC TCT CCA CTT CCC AAC CCA-3'，預(yù)期產(chǎn)物為109 bp，由上海生工合成。

1.2.4 電泳 取5 μlPCR產(chǎn)物，采用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 熒光定量PCR（FQ-PCR）檢測(cè)組織標(biāo)本p14mRNA表達(dá) 采用SYBR Green熒光染料進(jìn)行FQ-PCR：（1）按Trizol試劑說明提取組織總RNA；（2）引物序列：p14mRNA：F5'-GAG ACA GAA TGG AGG TGC TGC-3'，R5'-GTA AGA TGA TTG GAA TTA TCTTCT-3'， 預(yù) 期 產(chǎn) 物 為 170bp；GAPDHmRNA：F5'-AAC GGA TTT GGT CGT ATT GGG-3'，R5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCGC-3'，預(yù)期產(chǎn)物233 bp，由上海生工合成：逆轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA 合成：取總 RNA 10 μl，Oligo（dT）5 pmols，65℃ 5 min之后插入冰中，加入 5× Buffer 4 μl，10 mmolPL dNTPs 2 μl，MMLV 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 100 U，RNase抑制劑 20 U，加 DEPC 水至 20 μl，42 ℃ 1 h；FQ-PCR 反應(yīng)體系為 25 μl，其中包含 0.7 μl SYBR Green染料，Mg2+濃度為3.5 mol/L，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性 5 min，95℃反應(yīng) 30 s，56℃復(fù)性 30 s，72℃延伸30 s，共50個(gè)循環(huán)后，72℃延伸7 min，每樣本4個(gè)復(fù)孔，在CFD-3220 DNA Engine Option自動(dòng)熒光PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。

1.4 p14基因蛋白表達(dá)的檢測(cè) p14即用型多克隆抗體（購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）、第一抗體兔抗人p14多克隆抗體、第二抗體超敏鏈酶卵白素-過氧化酶（S-P）試劑盒和DAB顯色試劑盒均為即用型。提取卵巢癌組織、良性腫瘤組織和正常卵巢組織的蛋白。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)p14蛋白的表達(dá)，具體方法為：將切片脫蠟至水，于3%過氧化氫甲醇液中37℃孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物活性。以1∶10稀釋的抗原修復(fù)液高溫修復(fù)，加一抗室溫下孵育60 min，加生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育20 min，加S-P溶液37℃孵育30 min。DAB顯色，顯微鏡下觀察3～10 min，蘇木素復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片。

1.5 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 在400倍顯微鏡下觀察患者標(biāo)本中p14蛋白表達(dá)的情況，其中陽性表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞核和（或）胞漿為棕黃色顆粒。觀察時(shí)，每張切片均選定10個(gè)觀察視野，每個(gè)視野以100個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)。陰性：細(xì)胞數(shù)＜5%，以“－”表示；弱陽性：細(xì)胞數(shù)為5%～25%，以“＋”表示；中等強(qiáng)度：陽性細(xì)胞數(shù)為25%～50%，以“＋＋”表示；強(qiáng)陽性：細(xì)胞數(shù)＞50%，以“＋＋＋”表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)處理采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，甲基化頻率等計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)及Fisher檢驗(yàn)，各組患者蛋白相對(duì)含量等計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組患者p14基因甲基化情況分析 所有患者中均未發(fā)現(xiàn)p14的高甲基化。見圖1。

圖1 p14基因甲基化情況

2.2 p14mRNA表達(dá)水平 p14mRNA在正常卵巢組織中的水平為（0.57±0.41），在卵巢癌組織的水平為（0.83±0.07），在良性腫瘤組織中的水平為（0.62±0.39）。p14mRNA在卵巢癌組織中的水平與正常組織和良性腫瘤組織中的相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；p14mRNA在正常組織和良性腫瘤組織中的水平相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。

2.3 p14蛋白的表達(dá)變化 p14蛋白表達(dá)在上皮性卵巢癌、良性卵巢腫瘤和正常卵巢組織中的陽性率分別為37.8%、73.3%和85.0%，三組中p14蛋白表達(dá)的陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。p14蛋白在13例G3病例中只有3例陽性，陽性率為23.1%；18例G2病例中6例陽性，陽性率為33.3%；14例G1病例中8例陽性，陽性率為57.1%。卵巢癌Ⅰ～Ⅱ期p14蛋白陽性表達(dá)率為40.0%、Ⅲ期p14蛋白陽性表達(dá)率為37.5%和Ⅳ期p14蛋白陽性表達(dá)率為33.3%，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。見表1。

表1 卵巢腫瘤中p14蛋白表達(dá)情況分析

3 討論

在正常細(xì)胞中，p14基因參與細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的調(diào)控，其產(chǎn)物p14蛋白可與MDM2-P53結(jié)合產(chǎn)生P53-MDM2-ARF三聚體復(fù)合物，阻斷MDM2誘導(dǎo)的p53蛋白降解，將p53蛋白的半衰期延長(zhǎng)至15～75 min，使p53發(fā)揮門衛(wèi)作用，調(diào)控細(xì)胞周期，誘導(dǎo)周期停滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的發(fā)生。甲基化是抑癌基因失活的機(jī)制之一，主要是胞嘧啶-磷酸 -鳥嘌呤（Cytosine-phosphate-Guanosine，CpG）二核苷酸發(fā)生甲基化，甲基化后抑癌基因不表達(dá)，這可能是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制之一，在某些情況下可能是唯一機(jī)制[1]。p14基因表達(dá)異常包含遺傳學(xué)層面（基因突變和缺失）和表觀遺傳學(xué)層面（DNA甲基化）的。p14異常表達(dá)可表現(xiàn)為高度甲基化，這可能是p14-p53作用途徑的主要調(diào)節(jié)機(jī)制之一，影響著癌癥的發(fā)展。據(jù)文獻(xiàn)顯示，在肺癌、膀胱癌、肝癌、鼻咽癌及腸癌患者中p14基因出現(xiàn)高甲基化。Xiaofang L等研究發(fā)現(xiàn)膽管癌中p14的甲基化率為24.0%，而正常組織中未發(fā)現(xiàn)甲基化，且甲基化程度與膽管癌的病理生物學(xué)行為及患者預(yù)后有關(guān)[2]。Lassacher A等研究發(fā)現(xiàn)Merkel細(xì)胞癌中p14的甲基化率為42.0%，未發(fā)現(xiàn)p14基因的突變，認(rèn)為p14的甲基化與皮膚Merkel細(xì)胞癌的發(fā)生有關(guān)[3]。有關(guān)子宮內(nèi)膜癌的研究顯示，p14表達(dá)異常促進(jìn)了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展[4～5]。卵巢癌的發(fā)生與甲基化密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn) RASSF1A[6]、OPCML[7]、BRCA1[8]、WWOX[9]和ING4[10]在卵巢癌均出現(xiàn)高甲基化。但Teodoridis JM檢測(cè)了106例Ⅲ/Ⅳ期上皮性卵巢癌中24個(gè)基因的CpG島甲基化情況，其結(jié)果顯示OPCML、DCRI、RASSGIA、HICI、BRCAI和 MINT25 的甲基化率分別是 33.3%、30.7%、36.4%、17.3%、12.3%和 12.0%，其余的基因未檢測(cè)到甲基化（APAF-1，DAPK，F(xiàn)ANCF，F(xiàn)AS，p14，p21，p73，SOCS-3 和 SURVIVIN）或 是 低 甲 基 化 （OPCML，DCR1，RASSF1A，MINT25，HIC1 和 SFRP1）[11]。

本研究顯示，在正常卵巢組織和卵巢良性腫瘤中未發(fā)現(xiàn)p14的高甲基化，上皮性卵巢癌中也未發(fā)現(xiàn)p14甲基化。采用熒光定量PCR（FQ-PCR）檢測(cè)組織標(biāo)本中的p14mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示卵巢癌標(biāo)本中p14mRNA表達(dá)水平明顯高于卵巢良性腫瘤及正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。免疫組化顯示上皮性卵巢癌中p14蛋白表達(dá)明顯低于良性卵巢腫瘤和正常卵巢組織中的表達(dá)，三組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。分化程度隨組織異型性和p14蛋白缺失率增高而增高，但各組之間相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。Ⅲ期和Ⅳ期卵巢癌中p14蛋白表達(dá)缺失率較Ⅰ～Ⅱ期低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。提示p14基因異常表達(dá)與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展有一定關(guān)系，但表達(dá)異?？赡懿皇羌谆拢琾14基因甲基化失活在散發(fā)性卵巢癌中并不常見。與湯紹輝等研究的大腸癌中p14基因表達(dá)異常是p14基因甲基化所致不同[12]，這可能與缺少同類研究以及我們的研究在病例種類的構(gòu)成、標(biāo)本量等方面的局限有關(guān)，也可能與實(shí)驗(yàn)方法的不同有關(guān)；再者可能是甲基化發(fā)生率與卵巢上皮性腫瘤的組織學(xué)類型及卵巢癌分期密切相關(guān)，這樣可以解釋各研究者所報(bào)道的同一種基因在卵巢癌中的甲基化率不同，先前報(bào)道的卵巢癌中高甲基化多是在生殖細(xì)胞癌和透明細(xì)胞癌中[13]，而本研究中無卵巢生殖細(xì)胞癌病例，透明細(xì)胞癌僅1例。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論有待進(jìn)一步的研究和擴(kuò)大標(biāo)本量得以證實(shí)。

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