金 雙 高連印 趙夢培 車念聰 張秋云 杜宇瓊

(首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)學(xué)系 中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點實驗室， 北京 100069)

慢性重型肝炎(chronic severe hepatitis，CSH)是以肝細(xì)胞的廣泛變性、壞死，出現(xiàn)肝衰竭為主要特征的嚴(yán)重肝臟疾病[1]。研究[2]表明，CSH常伴隨腸道通透性增高，導(dǎo)致內(nèi)毒素大量入血，內(nèi)毒素在加重肝損傷同時激活肝細(xì)胞線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。因此，在治療上，除了挽救和修復(fù)嚴(yán)重?fù)p害的肝細(xì)胞，促進(jìn)患者的肝細(xì)胞再生之外，抑制肝細(xì)胞的凋亡也是治療CSH的重要環(huán)節(jié)[3]。清毒湯是王融冰教授治療重癥肝炎的經(jīng)驗方，具有清熱解毒、滋陰通下的功能，能夠改善CSH患者的癥狀和體征。前期研究[4-6]表明清毒湯臨床治療慢性重型肝炎安全有效，對模型大鼠有保肝、降低腸道通透性、抑制NF-κB活性的作用。本課題使用硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)灌胃建立重癥肝損傷大鼠模型，運用Western blotting等技術(shù)分析肝細(xì)胞線粒體凋亡途徑中關(guān)鍵分子Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)，用TUNEL法檢測肝細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)探討清毒湯降低內(nèi)毒素產(chǎn)生、抑制肝細(xì)胞線粒體凋亡通路減輕慢性重型肝炎的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wistar大鼠72只，雌雄各36只，體質(zhì)量190～210 g，實驗動物許可證號: SCXK(京) 2012-0001。北京維通利華實驗技術(shù)有限公司提供，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)科研樓動物實驗中心SPF級動物房，分籠飼養(yǎng)，溫度(22.0±1.0)℃，相對濕度(50.2±1.0)%，自由進(jìn)食飲水。每隔12 h開燈照明。所有實驗操作均經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號：AEEI-2016-137)。

1.2 實驗試劑

清毒湯藥物組成: 大黃10 g、枳實10 g、厚樸10 g、玄參10 g、茜草9 g、生地黃12 g，上述藥物均購自北京中醫(yī)醫(yī)院，由首都醫(yī)科大學(xué)煎藥室煎制，煎煮濃縮成生藥質(zhì)量濃度為1.6 g /mL 的水煎劑，分裝，4℃冰箱保存?zhèn)溆?，灌胃前水浴加熱，搖勻。

TUNEL試劑盒(貨號：11684817910，瑞士Roche公司)；DAB顯色劑(貨號：K5007，丹麥DAKO公司)；硫代乙酰胺(貨號：S0646，北京科奧科技有限公司)；乳果糖(貨號：ka0009454，北京科奧科技有限公司)；Bax抗體(貨號：2772S，美國Cell Signaling Technology公司) ； Bcl-2 抗體(貨號：SC-509，美國Santa Cruz公司) ；β-actin(貨號：4967，美國Cell Signaling Technology公司)。

1.3 造模及給藥

72只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，采用Excel隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為正常組12只，造模組60只。本實驗采用TAA誘導(dǎo)大鼠重度肝損傷模型[4]。前8周造模組予以TAA 12 mg· kg-1·d-1進(jìn)行灌胃，正常組予以等量的0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液灌胃。并在第8周末采用數(shù)字表法將所有造模組隨機(jī)分為模型組乳果糖治療組、清毒湯治療組(小劑量、中劑量、大劑量組)，每組12只。第9～12周，所有造模組大鼠將TAA的量增加至36 mg· kg-1·d-1，同時，乳果糖組則給予3.5 mL· kg-1·d-1的乳果糖；清毒湯小、中、大劑量組給予清毒湯生藥制劑量分別為5.08、10.17、20.33 g· kg-1·d-1。正常組仍給予等量的0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液。造模及治療期間，所有動物在實驗條件下自然飲食，在造模第12周末夜間禁食。

1.4 標(biāo)本制備

造模過程中大鼠死亡15只，剩余大鼠57只。上述所有剩余大鼠在第12周末禁食10～12 h后，采用10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉，給藥量為0.35 mL/100 g。開腹，腹主動脈無菌取血，緩慢注射于無菌真空采血管內(nèi)，3 000 r/min，4℃，離心15 min，取其上清液分裝，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。取剩余肝組織在冰板上快速剪碎后分裝于凍存管內(nèi)，用液氮進(jìn)行速凍，隨后將組織移至-80℃冰箱存放。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 原位細(xì)胞凋亡檢測(TUNEL法)

肝組織用10%(體積分?jǐn)?shù))甲醛溶液固定后進(jìn)行石蠟包埋、切片，常規(guī)脫蠟、水化，按照TUNEL檢測試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。DAB顯色，蘇木素復(fù)染。6組各隨機(jī)選5個高倍鏡視野進(jìn)行觀察，每個視野計數(shù)100個肝細(xì)胞核。細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，最后計算凋亡細(xì)胞百分比的均數(shù)。

1.5.2 Western blotting法檢測肝組織中Bax、Bcl-2 蛋白相對表達(dá)量

取適量肝組織冰上融化，細(xì)胞裂解液處理，離心后取上清，通過電泳將蛋白分開并轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，用含5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉的TBST封閉1 h，Bax一抗(1∶1 000)、Bcl-2一抗(1∶200)37℃溫育過夜，用TBST洗滌3次，每次10 min，二抗(1∶10 000)，37℃溫育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min，滴加熒光底物發(fā)光顯色。用Image Pro Plus進(jìn)行灰度統(tǒng)計。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 肝組織TUNEL檢測

本實驗中凋亡細(xì)胞為棕黃色的圓形或卵圓形致密板塊(圖1箭頭所示)。正常組基本未見細(xì)胞凋亡(圖1A)；模型組可見大量深褐色凋亡細(xì)胞(圖1B)；與模型組比較，乳果糖組和清毒湯各組凋亡細(xì)胞各有不同程度減少(圖1C～F)，其中中劑量和大劑量凋亡細(xì)胞減少更明顯，詳見表1。

TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡率要求樣本量≥3只即可，此處根據(jù)大鼠各組剩余情況選擇樣本量為5只。

圖1 肝組織TUNEL檢測結(jié)果Fig.1 TUNEL detection of apoptotic rate in rat liver cell(400×)

A：normal control group;B:model group;C: lactulose group;D: small dosage group of Qingdu decoction;E: medium dosage group of Qingdu decoction;F: large dosage group of Qingdu decoction；Arrowshowed an apoptotic live cell；TUNEL：terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling.

表1 各組大鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)比較Tab.1 Comparison of apoptotic index ofrat liver cells in each group ()

*P<0.05，* *P<0.01vsnormal control group；△△P<0.01vsmodel group；▲▲P<0.01vslactulose group;QDTS: small dosage group of Qingdu decoction;QDTM: medium dosage group of Qingdu decoction;QDTL: large dosage group of Qingdu decoction;AI: apoptotic index,n=5 for each group.

2.2 清毒湯對肝細(xì)胞中Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠Bax蛋白相對表達(dá)水平升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白、Bcl-2/Bax比值降低(P<0.01)；與模型組比較，所有治療組(乳果糖組和清毒湯各組)Bcl-2蛋白表達(dá)量、Bcl-2/Bax比值升高(P<0.05或P<0.01)，Bax蛋白相對表達(dá)水平下降(P<0.01)，其中清毒湯中劑量組和大劑量組表現(xiàn)最明顯，但是中、大劑量之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與乳果糖組比較，清毒湯中劑量和大劑量Bcl-2蛋白相對表達(dá)量、Bcl-2/Bax比值增高(P<0.01)，Bax蛋白相對表達(dá)量減低(P<0.01)，但清毒湯中、大劑量組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2、表2)。

Western blotting法在外文文獻(xiàn)中要求樣本量≥3只，而在中文文獻(xiàn)中要求滿足每組≥5只即可，所以此處每組選擇 5 只。

圖2 各組大鼠肝組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)Fig.2 Protein expressions of Bax，Bcl-2 inrats in each group

A：normal control group;B:model group;C: lactulose group;D: small dosage group of Qingdu decoction;E: medium dosage group of Qingdu decoction;F: large dosage group of Qingdu decoction.

表2 各組大鼠肝組織Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)水平比較Tab.2 Comparision of protein expressions of Bax，Bcl-2 in rats in each group()

3 討論

中醫(yī)古籍中 “瘟黃”、 “急黃”、“肝瘟”等疾病的描述符合現(xiàn)代CSH的臨床表現(xiàn)[7]。目前中醫(yī)對該病的認(rèn)識：本虛標(biāo)實，因虛致實，“毒、瘀、虛”是關(guān)鍵具有普遍性[8]；首都國醫(yī)名師王融冰教授亦提出CSH病位在肝絡(luò)，病機(jī)乃因虛致實，虛者肝體俱虛，多臟虛損，實者乃毒瘀膠著，邪氣雍滯[5]，受李梃“肝與大腸相通”理論啟示，提出了“通腸治肝”治療CSH的新思路，并創(chuàng)制了治療本病新的中藥方劑清毒湯。前期研究[4-6]證實清毒湯治療TAA致重癥肝損傷大鼠療效顯著。本次實驗顯示，清毒湯能夠明顯降低CSH大鼠病死率，提高大鼠的生存質(zhì)量，與之前的結(jié)果一致。從TUNEL染色顯示的結(jié)果看，清毒湯能夠明顯改善CSH大鼠肝細(xì)胞凋亡情況，從而達(dá)到保護(hù)肝功能的作用。

目前在已知的細(xì)胞凋亡的途徑中，線粒體途徑被公認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)[9-12]。而由 NF-κB 介導(dǎo)的 Bcl-2 家族蛋白被認(rèn)為是線粒體凋亡途徑中的主要調(diào)控蛋白[13]。Bcl-2蛋白和Bax蛋白都是Bcl-2 家族蛋白的重要組成部分，Bcl-2蛋白主要附著在線粒體膜上，當(dāng)其與線粒體膜上的離子通道結(jié)合時可以調(diào)節(jié)Cyt-c的釋放。另外，研究[14-15]顯示Bcl-2能夠降低線粒體復(fù)合物的活性，使線粒體內(nèi)Cyt-c的含量減少，同時能夠與凋亡肽酶激活因子結(jié)合，阻止線粒體內(nèi)Cyt-c釋放到胞質(zhì)中，并且阻止Caspase被胞質(zhì)中Cyt-c激活，阻斷凋亡的發(fā)生。Bax 則能夠促進(jìn)線粒體內(nèi)Cyt-c釋放，具有拮抗 Bcl-2 蛋白抑制細(xì)胞凋亡的作用，最終促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。Bcl-2 的抗凋亡效應(yīng)及 Bax 的促凋亡效應(yīng)已得到普遍認(rèn)可，而Bcl-2、Bax 的比值對細(xì)胞凋亡機(jī)制也有重要影響，提高 Bcl-2/Bax 的比值，可抑制細(xì)胞凋亡，而降低 Bcl-2/Bax 的比值，則會促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

本實驗結(jié)果顯示，模型組肝組織Bax蛋白表達(dá)量較正常組顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)量較正常組顯著降低，而各治療組(乳果糖組、清毒湯大、中、小劑量組)Bax蛋白及Bcl-2蛋白水平較模型組分別有不同程度降低和升高，其中清毒湯中劑量組表現(xiàn)最明顯。

同時，各治療組大鼠肝組織TUNEL的病理檢測結(jié)果提示清毒湯中、大劑量組較模型組肝細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著減少，但清毒湯中、大劑量組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。故推測清毒湯方可能通過調(diào)控Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)來減輕肝細(xì)胞的凋亡，從而改善肝臟病理結(jié)構(gòu)，達(dá)到保護(hù)肝臟的作用，這些結(jié)果為本方臨床治療CSH疾病提供了依據(jù)。

[1] Quarato G， Scrima R， Aqriesti F， et al. Targeting mitochondria in the infection strategy of the hepatitis C virus[J]. Int J Biochem Cell Biol，2013, 45(1): 156-166.

[2] 王文遞，林雅玲，宋彬妤,等.內(nèi)毒素在肝胰島素抵抗中對肝細(xì)胞線粒體功能的影響[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2017，14(12):33-38.

[3] 劉海成，閏秀川，劉平,等.基于肝細(xì)胞凋亡與網(wǎng)狀支架破壞探討抗肝纖維化中藥的作用機(jī)制與治法特點[J]. 世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2007，9(6)：40-45.

[4] 羅佳佳，高連印，金雙,等.清毒湯對重癥肝損傷大鼠腸道黏膜通透性的影響[J]. 環(huán)球中醫(yī)藥, 2017，10(3):261-264.

[5] 曹吳冰，高連印，車念聰,等. 清毒湯對實驗性重癥肝損傷大鼠內(nèi)毒素及D-乳酸表達(dá)的影響[J]. 環(huán)球中醫(yī)藥, 2015，8(11)：1333-1336.

[6] 曹吳冰，高連印，車念聰,等. 清毒湯對實驗性重癥肝損傷大鼠腫瘤壞死因子α及核轉(zhuǎn)錄因子κB表達(dá)的影響[J]. 環(huán)球中醫(yī)藥, 2015，8(10)：1186-1189.

[7] 官志杰，韋艾凌，毛德文,等.慢性重型肝炎的“毒、濁”致病機(jī)制[J].時珍國醫(yī)國藥，2014，25(1)：148-149.

[8] 胡建華，李曉東，姚乃禮,等.中醫(yī)藥診治慢性重型肝炎研究進(jìn)展述評[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2013，23(2)：125-128.

[9] 張如意，張麗，李林.線粒體功能障礙、α-突觸核蛋白與帕金森病[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2015，36(6)：861-864.

[10] 岳志偉，劉強(qiáng)，陳乃耀.創(chuàng)傷性腦損傷和線粒體功能障礙[J].中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2016，19(4):645-650.

[11] 熊瑞媛, 田煒,楊方.細(xì)胞凋亡途徑在心肌缺血/再灌注損傷中的研究進(jìn)展[J].中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2015,18(3):512-515.

[12] 蒙萍，王寧，漆欣柱，等.模擬海拔8000m高原缺氧環(huán)境對大鼠腦組織線粒體自噬的影響[J].解放軍醫(yī)藥雜志，2016，28(6):9-13.

[13] Bonneau B， Prudent J， Popqeorgiev N， et al. Non-apoptotic roles of Bcl-2 family: the calcium connection[J]. Biochim Biophys Acta， 2013，1833(7): 1755-1765.

[14] 王林，潘曉濤，耿智敏,等.RNA干擾Bcl-2基因表達(dá)對人膽囊癌細(xì)胞株GBC-SD裸鼠移植瘤生長的影響[J]. 西安交通大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2009，30(11)：93-96.

[15] Zhang H， Li Q， Li Z， et al. The protection of Bcl-2 over expression on rat cortical neuronal injury caused by analogous ischemia/reperfusion in vitro[J]. Neurosci Res， 2008， 62(2): 140-146.