張文麗 孔凡虹 何 露 董成亞 王雅杰，3*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100050；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室，北京 100050；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室，北京 100050；3. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100015)

腦膠質(zhì)瘤是一種顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，特別是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，惡性程度最高，呈浸潤性生長，預(yù)后最差，對多種治療方案具有高耐受性[1-4]。膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增生、遷移和侵襲造成膠質(zhì)瘤的浸潤性生長，難以與周圍組織分清界限，并侵襲重要神經(jīng)血管，在腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[5]。U87細(xì)胞系是惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，廣泛應(yīng)用于膠質(zhì)瘤的科學(xué)研究中[6]。

美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection， ATCC) 和美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health， NIH)等機(jī)構(gòu)建立在實(shí)驗(yàn)前對所使用細(xì)胞系進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定[7-8]。在本課題組[9]前期研究中，利用人類細(xì)胞系鑒定金標(biāo)準(zhǔn)——短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats，STR)分型檢測技術(shù)對實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的3株U87細(xì)胞系進(jìn)行了鑒定，篩選出2株真正的U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，分別為ATCC數(shù)據(jù)庫中U-87MG Glioblastoma-Astrocytoma Human細(xì)胞、德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ)數(shù)據(jù)庫中U-87MG細(xì)胞，兩細(xì)胞株未出現(xiàn)污染現(xiàn)象，細(xì)胞株來源的患者性別不同，其他用于鑒定的STR位點(diǎn)一致[10]。然而，兩株U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系生物學(xué)特性以及是否能夠應(yīng)用于后續(xù)的科研實(shí)驗(yàn)尚未確定。

本研究采用CCK-8法、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)等方法，對兩細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)特性的比較。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系：U87-A：ATCC數(shù)據(jù)庫中U-87 MG Glioblastoma-Astrocytoma Human；U87-D：DSMZ數(shù)據(jù)庫中U-87 MG。

2)儀器設(shè)備：多氣體培養(yǎng)箱(型號(hào)MAO-18M，日本三洋公司)，離心機(jī)(型號(hào)DZ47-63，北京白洋醫(yī)療器械有限公司)，ESCO OptiMair?垂直流超凈工作臺(tái)(型號(hào)ACB-4A1，新加坡ESCO公司)，倒置顯微鏡(型號(hào)Axiovert 40，德國ZEISS公司)，多功能酶標(biāo)儀(型號(hào)SpectraMax M5，美國Molecular Devices公司)。

3)主要試劑：DMEM、胎牛血清(美國Gibco公司)，0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶、PBS緩沖液(美國Hyclone公司)，CCK-8試劑(日本同仁化學(xué))，Transwell小室(美國Costar公司)，Matrigel膠(美國 BD公司)。

1.2 細(xì)胞生長特性以及形態(tài)特征觀察

分別復(fù)蘇1支U87-A、U87-D凍存細(xì)胞于T25培養(yǎng)瓶中，做好標(biāo)記，使用含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5%CO2(體積分?jǐn)?shù))、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)過程中使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的一般形態(tài)及生長速度。復(fù)蘇后24 h及培養(yǎng)72 h拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 細(xì)胞生長曲線(CCK-8法)

取對數(shù)生長期細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基制成2.5×104/mL單細(xì)胞懸液，接種至96孔板中(100 μL/孔，即2.5×103個(gè)細(xì)胞/孔)，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)[37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2]。培養(yǎng)6、24、48、72 h，每個(gè)時(shí)間段5個(gè)重復(fù)，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h后，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)擬合細(xì)胞生長曲線。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)

先用Marker筆在6孔板背后，均勻劃橫線，大約每隔0.5～1.0 cm劃一道，橫穿過孔。在孔中加入約1×106個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿時(shí)，用槍頭盡量垂直于背后的橫線劃痕。用PBS洗滌細(xì)胞，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基。繼續(xù)放入37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。劃痕后0 h和繼續(xù)培養(yǎng)24 h后拍照。設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果用遷移率表示，遷移率=(劃痕0 h距離-劃痕24 h后距離)/劃痕0 h距離。

1.5 Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)

1)遷移實(shí)驗(yàn)：取對數(shù)生長期細(xì)胞，用無血清DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞密度稀釋為5×104個(gè)/mL。在Transwell小室的內(nèi)室加入100 μL的上述細(xì)胞混懸液，外室內(nèi)加入600 μL含20%(體積分?jǐn)?shù))血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后終止培養(yǎng)，棄去外室的培養(yǎng)液，PBS洗滌后，用4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定細(xì)胞約20 min，0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))結(jié)晶紫常溫染色30 min。棄去內(nèi)室液體，PBS洗2遍，用棉簽輕輕擦拭內(nèi)室上室面的細(xì)胞。風(fēng)干后置于顯微鏡下，每個(gè)小室隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)穿到下室的細(xì)胞數(shù)量，取均值，以遷移細(xì)胞的相對數(shù)目來表示腫瘤細(xì)胞的遷移能力。設(shè)3個(gè)平行小室，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2)侵襲實(shí)驗(yàn)：將50 mg/L Matrigel用無血清DMEM培養(yǎng)基將其按1∶8比例稀釋混勻，取40μL包被Transwell小室底部膜的上室面，置于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中，2 h后待用，待Matrigel膠凝為膠狀時(shí)可開始加樣。其他步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。設(shè)3個(gè)平行小室，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長特性以及形態(tài)特征

U87-A與U87-D細(xì)胞生長特性以及形態(tài)特征較為相似，兩細(xì)胞系均為貼壁型，細(xì)胞多呈扁平不規(guī)則形，中間有圓形細(xì)胞核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層，有長短不一的突起。復(fù)蘇約2 d后生長呈網(wǎng)狀，3～4 d可傳代。經(jīng)液氮或-150 ℃低溫凍存后復(fù)蘇仍能繼續(xù)增生，顯微鏡下形態(tài)見圖1。

圖1 兩細(xì)胞系顯微鏡下形態(tài)Fig.1 Microscope morphology of the two cell lines

A：morphology of U87-A after 24 h recovery；B：morphology of U87-A after 72 h recovery;C:morphology of U87-D after 24 h recovery；D：morphology of U87-D after 72 h recovery.

2.2 細(xì)胞生長曲線

CCK-8法檢測細(xì)胞的生長增生能力，結(jié)果提示U87-A在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)吸光度值分別為：0.395±0.009、0.878±0.027、1.949±0.127、2.192±0.085，U87-D在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)吸光度值分別為：0.397±0.006、0.777±0.022、1.748±0.081、1.909±0.086。細(xì)胞生長曲線顯示U87-A較U87-D生長速度稍快，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩株細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)72 h，均達(dá)到對數(shù)生長期且生長良好，可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)(圖2)。

2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)

劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果提示U87-A和U87-D細(xì)胞劃痕24 h后細(xì)胞遷移率分別為 0.42±0.05、0.39±0.03，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3)。

圖2 細(xì)胞生長曲線Fig.2 Cell growth curve

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力Fig.3 Migration ability of cell detected by scratch test(40×)

A：0 h after the U87-A scratch test；B：24 h after the U87-A scratch test；C：0 h after the U87-D scratch test；D：24 h after the U87-D scratch test.

2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)

U87-A和U87-D細(xì)胞遷移到下室的細(xì)胞數(shù)分別為269.33±17.39、239.00±13.74，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖4)。

U87-A和U87-D細(xì)胞侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)分別為182.33±8.74、214.00±13.53，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，U87-D細(xì)胞侵襲能力高于U87-A細(xì)胞(圖5)。

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力Fig.4 Migration ability of cell detected by Transwell assay(100×)A：Cells of U87-A cell line were migrated to the lower chamber；B：Cells of U87-D cell line were migrated to the lower chamber.

圖5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力Fig.5 Invasion ability of cell was detected by Transwell assay(100×)A：Cells of U87-A cell line were invaded to the lower chamber；B：Cells of U87-D cell line were invaded to the lower chamber.

3 討論

科研實(shí)驗(yàn)中對細(xì)胞系進(jìn)行質(zhì)量控制，去除錯(cuò)誤和發(fā)生交叉污染的細(xì)胞，能夠保證后續(xù)研究的準(zhǔn)確性[7，11]。在本課題組[9]前期研究中，利用STR分型檢測技術(shù)篩選出了兩株U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，但對于兩細(xì)胞系生物學(xué)特性了解甚少。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，了解使用細(xì)胞系的生物學(xué)特性對實(shí)驗(yàn)的成敗同樣至關(guān)重要。

腫瘤細(xì)胞與體內(nèi)正常細(xì)胞相比，在形態(tài)、生長增生、遷移以及侵襲等方面具有顯著不同。其在體內(nèi)和體外培養(yǎng)均表現(xiàn)為不受控增生性，具有無限的復(fù)制能力，在低血清中仍能生長。腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力造成了腫瘤組織的浸潤和轉(zhuǎn)移，并能促進(jìn)血管生成[12-13]。

本研究利用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法，采用各種細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合顯微鏡下形態(tài)學(xué)特征，評價(jià)兩U87細(xì)胞系的生物學(xué)特性。兩細(xì)胞系復(fù)蘇后生長良好，均可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，顯微鏡下無明顯形態(tài)學(xué)差異。CCK-8增生實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增生能力的差異，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示兩細(xì)胞系遷移能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，后通過Transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其遷移能力，結(jié)果同劃痕實(shí)驗(yàn)。而Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示U87-D細(xì)胞侵襲能力高于U87-A。綜上所述，兩細(xì)胞系在形態(tài)學(xué)、生長增生及遷移能力方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，僅侵襲能力方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

U87細(xì)胞系能夠反應(yīng)腦膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性，目前已廣泛應(yīng)用于膠質(zhì)瘤的研究[14]中，對膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展各項(xiàng)機(jī)制的研究具有重要意義。本研究著眼于細(xì)胞應(yīng)用的實(shí)際需求，通過評價(jià)兩U87細(xì)胞系的生物學(xué)特性，對其各個(gè)方面有了更好的了解，對于細(xì)胞系的后續(xù)應(yīng)用具有重要價(jià)值。為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了選擇細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，可根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的細(xì)胞系，有助于后續(xù)研究的順利開展。

[1] Morgan L L. The epidemiology of glioma in adults: a “state of the science” review[J]. Neuro-oncology， 2015，17(4): 623-624.

[2] Ahmed R， Oborski M J， Hwang M， et al. Malignant gliomas: current perspectives in diagnosis， treatment， and early response assessment using advanced quantitative imaging methods[J]. Cancer Manag Res， 2014， 6:149-170.

[3] 李連進(jìn), 佟建洲,崔敬,等.腦膠質(zhì)瘤組織AKT和PTEN的測定意義[J].中華腫瘤防治雜志，2016,23(S1):24-25.

[4] 李巖, 石蕊,陳建新,等.VM-26和DDP聯(lián)合化療對復(fù)發(fā)高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤的治療體會(huì)[J].中華腫瘤防治雜志，2015，22(5):786-790.

[5] Xie Q， Mittal S， Berens M E. Targeting adaptive glioblastoma：an overview of proliferation and invasion[J]. Neuro Oncol， 2014， 16(12): 1575-1584.

[6] Kanno H， Sato H， Yokoyama T A， et al. The VHL tumor suppressor protein regulates tumorigenicity of U87-derived glioma stem-like cells by inhibiting the JAK/STAT signaling pathway[J]. Int J Oncol， 2013， 42(3):881-886.

[7] Barallon R， Bauer S R， Butler J， et al. Recommendation of short tandem repeat profiling for authenticating human cell lines， stem cells， and tissues[J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim，2010，46(9): 727-732.

[8] Masters， J R. Cell-line authentication: End the scandal of false cell lines[J]. Nature， 2012， 492(7428): 186.

[9] Dirks W G， Drexler H G. STR DNA typing of human cell lines: detection of intra-and interspecies cross-contamination[J]. Methods Mol Biol，2013，946:27-38.

[10] 張文麗，孔凡虹，賀文艷，等.細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞系鑒定及質(zhì)量控制重要性探討[J]. 標(biāo)記免疫分析與臨床， 2017， 24(1): 84-87.

[11] Masters， J R. Cell-line authentication: End the scandal of false cell lines[J]. Nature， 2012， 492(7428): 186.

[12] Lazebnik Y. What are the hallmarks of cancer?[J]. Nat Rev Cancer, 2010， 10(4): 232-233.

[13] Hanahan D， Weinberg R A. Hallmarks of cancer: the next generation[J]. Cell, 2011，144(5):646-674.

[14] 王維娜，梁月勉，趙春蘭.多灶性腦膠質(zhì)瘤伴肺轉(zhuǎn)移一例報(bào)告[J].中華腫瘤防治雜志，2015，22(4):312-314.