楊 軍 王 敏 張 羅,2*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 北京市耳鼻咽喉科研究所 教育部耳鼻咽喉頭頸科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鼻病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100730；2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院鼻過敏科，北京 100730)

過敏性鼻炎(allergic rhinitis, AR)是一種由接觸過敏原所導(dǎo)致的以打噴嚏、鼻癢、鼻堵和流鼻涕為主要癥狀的疾病。AR是最常見的過敏性疾病之一，世界范圍內(nèi)的發(fā)病率最高可達(dá)40%，且有逐年上升的趨勢(shì)[1-2]。

Th2反應(yīng)和過敏原特異性IgE的生成是AR的主要特征[3-4]。除此之外，很多因子參與了AR的發(fā)生。以往研究[5-10]報(bào)道過敏原特異性IgG1和IgG2a抗體的生成[5]、Th17細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(interleukin-17，IL-17)[6-8]和前炎性反應(yīng)因子IL-6[9-10]參與了AR的發(fā)病。AR的發(fā)病是個(gè)動(dòng)態(tài)過程，在早期臨床過敏癥狀出現(xiàn)之前已發(fā)生了多種免疫反應(yīng)，上述免疫因子在此階段變化如何，以及與過敏癥狀的關(guān)系如何，目前尚不清楚。

本研究通過建立卵清蛋白(ovalbumin, OVA)誘導(dǎo)的AR小鼠模型觀察激發(fā)早期和激發(fā)晚期上述細(xì)胞因子和免疫球蛋白抗體表達(dá)的差異，以探討AR早期無癥狀階段和晚期有癥狀階段上述免疫反應(yīng)的異同，這將有助于對(duì)AR發(fā)病機(jī)制的理解。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠，7～8周齡，體質(zhì)量20～25 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2016-0010。

1.2 OVA-誘導(dǎo)的AR小鼠模型的建立及實(shí)驗(yàn)方案

用BALB/c小鼠進(jìn)行AR 動(dòng)物模型的建立，具體建模方案同參考文獻(xiàn)[11]。簡(jiǎn)單過程為在第1天和第7天用含50 μg OVA和5 mg Al(OH)3的400 μL 0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液溶液進(jìn)行致敏性腹腔內(nèi)注射; 14 d后連續(xù)3周每周3 d鼻局部給予含50 μg OVA的 0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液溶液20 μL進(jìn)行激發(fā)。采用數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組，對(duì)照組、激發(fā)早期組和激發(fā)晚期組。對(duì)照組為用 0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液代替OVA致敏和激發(fā)，在第30天 0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液激發(fā)結(jié)束后2 h處理6只小鼠；激發(fā)早期組為在第16 天OVA激發(fā)結(jié)束后2 h處理6只小鼠；激發(fā)晚期組為在第30 天OVA激發(fā)結(jié)束后2 h處理6只小鼠。收集血清和鼻黏膜，鼻黏膜用于提取RNA，血清用于細(xì)胞因子和免疫球蛋白抗體檢測(cè)，詳見圖1。

1.3 鼻部過敏癥狀的檢測(cè)

最后一次激發(fā)后，立即計(jì)數(shù)20 min內(nèi)撓鼻和噴嚏的次數(shù)，然后取平均值。

1.4 血清 OVA特異性IgE和IgG抗體檢測(cè)

血清OVA特異性IgE、IgG1和IgG2a抗體用ELISA法檢測(cè)，具體方法參考文獻(xiàn)[12]。96孔板用100 μL 10 g/L OVA包被，4 ℃過夜，然后用含4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA 的 PBS室溫封閉1 h。加入100 μL血清樣品室溫孵育2 h，用含0.05%(體積分?jǐn)?shù))Tween 20的PBS 洗滌后，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠IgE (1∶4 000)、IgG1 (1∶5 000)或IgG2a (1∶5 000) (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL, 美國(guó)) 室溫孵育2 h。洗滌后用100 μL四甲基聯(lián)苯胺(Sigma-Aldrich)顯色。

圖1 AR小鼠模型的建立和實(shí)驗(yàn)方案Fig.1 AR mouse model and experimental protocolAR: allergic rhinitis.

1.5 Real-time PCR檢測(cè)

用Trizol(Invitrogen公司., 美國(guó))提取鼻黏膜組織總RNA，Oligo(dt)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后用Real-time PCR法檢測(cè)鼻黏膜干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)，IL-4，IL-17和IL-6基因表達(dá)。所用染料為Platinum SYBR Green q PCR SuperMixUDG，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，儀器為Rotor-GeneTM6200 HRM (Corbett Life Science, 澳大利亞)。引物序列見表1。結(jié)果用Delta Delta Ct法分析。

1.6 血清細(xì)胞因子檢測(cè)

血清細(xì)胞因子用小鼠Th1/Th2/Th17 cytometric bead array kit (BD PharMingen, La Jolla, CA, 美國(guó)) 檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠鼻部癥狀比較

撓鼻和打噴嚏是過敏性鼻炎的主要癥狀。撓鼻和打噴嚏次數(shù)在晚期激發(fā)組顯著高于早期激發(fā)組和

對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但在早期激發(fā)組和對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2)。

2.2 血清OVA-特異性IgE、IgG1和IgG2a濃度

血清OVA-特異性IgE, IgG1和IgG2a濃度在早期激發(fā)組和晚期激發(fā)組均顯著增高，且過敏原特異性IgG1和IgG2a在晚期激發(fā)組顯著高于早期激發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

2.3 鼻黏膜IFN-γ、L-4、IL-17和IL-6基因的表達(dá)

鼻黏膜IFN-γ基因(Th1因子)在3組間表達(dá)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IL-4基因(Th2因子)在晚期激發(fā)組表達(dá)顯著高于對(duì)照組；IL-17(Th17細(xì)胞因子)和前炎性因子IL-6基因在早期激發(fā)組和晚期激發(fā)組表達(dá)均顯著增高，且在晚期激發(fā)組的表達(dá)顯著高于早期激發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

2.4 血清IFN-γ、L-4、IL-17和IL-6蛋白的表達(dá)

血清Th1因子IFN-γ在3組間表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Th2因子IL-4在晚期激發(fā)組表達(dá)顯著高于對(duì)照組和早期激發(fā)組；Th17細(xì)胞因子IL-17和前炎性因子IL-6在早期激發(fā)組和晚期激發(fā)組小鼠均顯著增高，且在晚期激發(fā)組的表達(dá)顯著高于早期激發(fā)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列Tab. 1 Primers used for quantitative real-time PCR

IL:interleukin;IFN:interferon.

圖2 3組小鼠鼻部癥狀比較Fig.2 Comparison of the nasal symptoms among three groupsA：nasal rubbing; B:sneeze.

圖3 血清OVA-特異性IgE, IgG1和IgG2a濃度Fig.3 Serum OVA-specific IgE, IgG1 and IgG2aA：OVA-specifie IgE；B：OVA-specifie IgG1；C：OVA-specifie IgG2a；OVA：ovalbumin.

圖4 鼻黏膜IFN-γ, IL-4, IL-17和IL-6基因的表達(dá)Fig.4 Gene expression of cytokines in nasal mucosaA:IFN-γ; B:IL-4;C:IL-17;D:IL-6; IFN:interferon; IL:interleukin.

3 討論

Th2、Th17反應(yīng)和過敏原特異性IgE、IgG1和IgG2a的生成與AR有關(guān)，但是這些免疫因子是否參與了AR早期無癥狀階段免疫反應(yīng)，及與臨床過敏癥狀的關(guān)系如何，目前尚不清楚。為了探討此問題，本研究觀察了OVA誘導(dǎo)的AR小鼠激發(fā)早期和晚期階段鼻部過敏癥狀和這些免疫因子表達(dá)的變化。

本研究中OVA誘導(dǎo)AR小鼠模型激發(fā)早期階段沒有出現(xiàn)鼻部過敏癥狀，激發(fā)晚期階段出現(xiàn)明顯的鼻部過敏癥狀，所以用此激發(fā)早期和晚期階段分別代表AR早期無癥狀和AR晚期有癥狀階段。AR主要是Th2反應(yīng)[12]，本研究證實(shí)激發(fā)晚期有癥狀階段鼻黏膜IL-4基因表達(dá)和血清IL-4水平均顯著增高。盡管血清IL-4水平在激發(fā)晚期顯著高于激發(fā)早期和對(duì)照，但鼻黏膜IL-4基因表達(dá)無此趨勢(shì)，因此IL-4與過敏癥狀出現(xiàn)的是否有關(guān)還有待進(jìn)一步證實(shí)。鼻黏膜IFN-γ基因表達(dá)和血清IFN-γ蛋白水平在激發(fā)早期和晚期階段均未出現(xiàn)顯著變化，提示Th1反應(yīng)與AR早期無癥狀和晚期有癥狀階段均無關(guān)。

圖5 血清IFN-γ, IL-4, IL-17和IL-6蛋白的表達(dá)Fig.5 Protein expression of cytokine in SerumA:IFN-γ; B:IL-4;C:IL-17;D:IL-6; IFN:interferon; IL:interleukin.

過敏原特異性IgE的生成是AR的主要特征之一，有研究[13]顯示IgE的致敏程度和過敏癥狀出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)呈正比。本研究發(fā)現(xiàn)OVA-特異性IgE在AR早期沒有出現(xiàn)癥狀前也顯著升高，但在早期無癥狀階段和晚期有癥狀階段差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，因此不能證明過敏癥狀與過敏原特異性IgE有關(guān)。與以往研究[5]一致，本研究結(jié)果顯示OVA-特異性IgG1和IgG2a在AR晚期有癥狀階段顯著增高；而且這兩種免疫球蛋白抗體在早期無癥狀階段即有顯著增高，盡管顯著低于晚期有癥狀階段。這些結(jié)果表明OVA-特異性IgG1和IgG2a可能參與了AR早期無癥狀階段的反應(yīng)，且可能與鼻部過敏癥狀的出現(xiàn)有關(guān)。

以往研究[9-10]顯示前炎性因子IL-6參與了AR的發(fā)生。本研究中，IL-6在AR早期無癥狀階段和晚期有癥狀階段均顯著增高，且晚期有癥狀階段顯著高于早期無癥狀階段，提示IL-6可能參與了AR早期無癥狀階段的反應(yīng)，且其表達(dá)水平可能與過敏癥狀的出現(xiàn)有關(guān)。然而，IL-6是一種多功能的細(xì)胞因子，由多種細(xì)胞(如抗原提呈細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)在多種刺激下生成。因此，IL-6如何影響過敏癥狀的發(fā)生還有待進(jìn)一步研究。

IL-17(也稱為IL-17A)是IL-17家族的一員，主要由Th17細(xì)胞亞群生成[14]。有研究[15]顯示IL-17缺陷小鼠的過敏癥狀、血清IgE、嗜酸浸潤(rùn)、組胺和白三烯的釋放均顯著降低，說明IL-17參與了AR的發(fā)生。本研究中，激發(fā)早期階段鼻黏膜IL-17基因表達(dá)和血漿IL-17濃度顯著升高，提示IL-17可能也參與了AR早期無癥狀階段的反應(yīng)。有研究[8]報(bào)道血清IL-17濃度與臨床癥狀有關(guān)，與此一致，本研究發(fā)現(xiàn)鼻黏膜IL-17基因表達(dá)和血漿IL-17濃度在激發(fā)晚期階段顯著高于激發(fā)早期階段，這些證據(jù)支持IL-17表達(dá)可能與過敏癥狀有關(guān)。IL-17與IL-6表達(dá)趨勢(shì)相似，而IL-6的功能之一是促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化和IL-17的生成[16-17]，因此IL-6與過敏癥狀的關(guān)系可能是通過促進(jìn)IL-17生成發(fā)揮作用。

總之，本研究結(jié)果提示IL-17、IL-6和過敏原特異性IgG1和IgG2a抗體可能參與了AR早期無癥狀階段的反應(yīng)，且其表達(dá)水平可能與過敏癥狀的出現(xiàn)有關(guān)。

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