王 鑾 ，包怡紅 ，張 宇 ，劉冬蕾

（1.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.阿榮旗星河實業(yè)集團(tuán)有限公司，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 162750）

隨著國家退耕還林和生態(tài)文明建設(shè)的不斷深入，人們對經(jīng)濟(jì)林的重視程度也不斷提高。通過科學(xué)經(jīng)營管理，經(jīng)濟(jì)林可以產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益[1]。作為經(jīng)濟(jì)林中重要樹種之一的榛樹，是珍貴的木本糧油樹種[2]。其果實榛仁含油脂量高達(dá)50%～60%，蛋白質(zhì)含量20%～30%。榨油后的副產(chǎn)物榛仁粕中仍含有大量的優(yōu)質(zhì)植物蛋白，其含量占榛仁粕干質(zhì)量的40%～50%，但其利用率較低，常被作為飼料或肥料低價出售[3]。因此榛仁粕進(jìn)一步的加工利用不僅可以提高榛樹的經(jīng)濟(jì)附加值，還可以提供一種新型的蛋白質(zhì)資源。

眾多研究表明，蘊藏在蛋白質(zhì)中的多肽具有極強(qiáng)的生物活性，且食用安全，因而得到廣泛關(guān)注[4]。從目前的報道來看，活性肽的制備主要采用酶解法和微生物發(fā)酵法。榛仁肽的制備研究多集中于采用酶解法，王明爽等[5]利用Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶酶解榛仁蛋白，發(fā)現(xiàn)不同水解度的酶解物對小鼠的免疫功能具有不同的增強(qiáng)效果。而微生物發(fā)酵法制備榛仁肽的研究報道較為鮮見。與酶解法相比，微生物發(fā)酵法具有成本低、效率高等優(yōu)點，因而越來越受到研究學(xué)者們的關(guān)注，目前已有采用固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵方法制備大豆肽[6]、油茶肽[7]、花生肽[8]等活性肽的報道。與液態(tài)發(fā)酵相比，固態(tài)發(fā)酵法成本較低，發(fā)酵產(chǎn)物易回收，適合工業(yè)化生產(chǎn)活性肽。因此本研究中采用固態(tài)發(fā)酵法制備榛仁肽。

為充分利用榛仁蛋白資源，制備天然生物活性肽，本研究中以枯草芽孢桿菌和米曲霉為發(fā)酵菌株，利用混菌固態(tài)發(fā)酵的方法，通過單因素試驗和正交試驗對榛仁粕發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對不同發(fā)酵時間產(chǎn)物的體外抗氧化性及降血壓活性進(jìn)行研究，旨在為經(jīng)濟(jì)林作物資源高效開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

榛仁粕使用石油醚脫脂處理，油脂含量≤5%，蛋白質(zhì)含量51.19%，-20 ℃保存。

枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，來自東北林業(yè)大學(xué)食品微生物實驗室；米曲霉Aspergillus oryzae，來自中國普通微生物菌種保藏中心（CGMCC）。

1,2-二苯基代苦味肼基自由基（DPPH·），購自上海源葉生物科技有限公司；血管緊張素酶（ACE）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（HHL），購自美國Sigma公司；喹啉、苯磺酰氯，購自上海麥克林生化科技有限公司；茚三酮、三氯乙酸、鐵氰化鉀、硫酸銅等其他試劑均為分析純?？莶菅挎邨U菌培養(yǎng)采用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；米曲霉培養(yǎng)采用察氏培養(yǎng)基；固態(tài)培養(yǎng)基：榛仁粕10 g，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

iMark 型酶標(biāo)儀，日本BIO RAD公司；H/T20MM型臺式高速離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽，鞏義市予華儀器有限公司；YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司；DH6000A型電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；HZQ-X100型振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；FA2004B型電子分析天平、721可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 固態(tài)發(fā)酵工藝流程

固態(tài)發(fā)酵工藝流程如圖1所示。

圖1 固態(tài)發(fā)酵工藝流程Fig.1 Process fl ow of solid state fermentation

1.3.2 種子液的制備

在100 mL的相應(yīng)培養(yǎng)基中，接入1環(huán)活化后的菌種。設(shè)定培養(yǎng)條件為：枯草芽孢桿菌160 r/min、37 ℃培養(yǎng)24 h；米曲霉160 r/min、28 ℃培養(yǎng)72 h。用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌數(shù)為108cfu/mL，即可用于固態(tài)發(fā)酵。

1.3.3 固態(tài)發(fā)酵及多肽溶液的制備

向固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中按一定比例加入2種菌懸液，用無菌水調(diào)整培養(yǎng)基的水分含量，攪拌均勻后打散，在一定條件下發(fā)酵制備榛仁肽，發(fā)酵結(jié)束后于121 ℃滅酶10 min，加入100 mL蒸餾水磁力攪拌30 min，自然沉淀10 min，將上清液10 000 r/min，離心20 min。離心后的上清液微孔濾膜（0.45 μm）過濾，濾液即為粗多肽溶液，儲存于4 ℃條件下，用于進(jìn)一步分析測定。

1.3.4 水解度的測定

采用茚三酮方法[9-10]測定榛仁蛋白水解度。取粗多肽溶液0.5 mL定容至50 mL，取0.1 mL稀釋液于試管中并加入1.9 mL蒸餾水、1.0 mL顯色劑，同時做空白試驗?；靹蚝笾梅兴≈屑訜?5 min，然后冷水冷卻，加入5.0 mL 40%乙醇溶液混勻，放置15 min后以空白管調(diào)零，于570 nm處測定吸光值。水解度計算公式為：

式中：Ah為不同粗多肽溶液中的總游離—NH2含量（μmol/mL）；A0為原料蛋白中固有的游離—NH2含量（μmol/mL）；A總為原料蛋白強(qiáng)酸水解后的總游離—NH2含量（μmol/mL）。

1.3.5 多肽得率的測定

多肽含量以酸可溶性多肽計，將等體積的三氯乙酸（TCA）加入到粗多肽溶液中，靜置30 min后以10 000 r/min離心10 min，去除酸不溶性的蛋白。用雙縮脲法測定上清液中的多肽含量[11]。肽得率[12]計算公式為：

肽得率＝[(待測液中肽含量×總體積)/樣品總量]×100%。

1.3.6 固態(tài)發(fā)酵單因素試驗

以水解度和肽得率為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗。各因素分別設(shè)置為：枯草芽孢桿菌和米曲霉接種比例 2∶1、3∶ 2、1∶1、2∶3、1∶ 2，接種量5%、7.5%、10%、12.5%、15%，水分含量30%、40%、50%、60%、70%，發(fā)酵溫度28、31、34、37、40 ℃。在不同條件下發(fā)酵培養(yǎng)48 h。

1.3.7 正交試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用4因素3水平即L9(34)進(jìn)行正交試驗優(yōu)化，并在最佳組合的基礎(chǔ)上進(jìn)行驗證試驗。

1.3.8 多肽活性的測定

1.3.8.1 不同發(fā)酵時間榛仁肽的體外抗氧化活性

總還原力的測定參照Kaur等的方法[13]；DPPH自由基（DPPH·）清除率的測定參照Orhan 等的方法[14]；羥基自由基（OH·）清除率的測定參照包怡紅等的方法[15]；超氧陰離子自由基（O2-·）清除率的測定參照裴斐等的方法[16]。

1.3.8.2 不同發(fā)酵時間榛仁肽的體外降血壓活性

通過測定ACE酶抑制率來評價體外降血壓活性，參照黎觀紅的方法[17]進(jìn)行測定。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.0制圖，采用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗，顯著性水平設(shè)置P＜0.05。所有試驗重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)均取“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 菌種比例對水解度和多肽得率的影響

圖2 菌種比例對水解度和多肽得率的影響Fig.2 Effects of bacteria ratio on hydrolysis degree and polypeptide yield

菌種比例對水解度和多肽得率的影響如圖2所示。由圖2可知，隨著枯草芽孢桿菌和米曲霉接種比減小，榛仁粕的水解度和多肽得率均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當(dāng)枯草芽孢桿菌和米曲霉接種比為2∶1時，多肽得率最低，為12.43%；當(dāng)接種比為3∶2時，水解度最低，為14.15%。這可能是因為枯草芽孢桿菌接種比例過高時，在固體培養(yǎng)基中能迅速成為優(yōu)勢菌種，抑制米曲霉生長發(fā)育，因此各項指標(biāo)均呈現(xiàn)較低值。同理，在米曲霉比例高時，各項指標(biāo)也呈現(xiàn)降低趨勢。當(dāng)接種比為2∶3時，水解度和多肽得率均達(dá)到最大值，分別為22.52%和15.15%，2種菌株可以共生，共同產(chǎn)生蛋白酶，水解榛仁蛋白，生成小分子肽。經(jīng)綜合分析，選取菌種比例1∶1、2∶3、2∶1 這3個水平用于正交試驗。

2.1.2 接種量對水解度和多肽得率的影響

圖3 接種量對水解度和多肽得率的影響Fig.3 Effects of inoculation concentration on hydrolysis degree and polypeptide yield

接種量對水解度和多肽得率的影響如圖3所示。由圖3可知，接種量在5.0%～12.5%時，水解度和多肽得率呈現(xiàn)上升趨勢，在接種量為12.5%時水解度和多肽得率達(dá)到最大值，分別為24.08%和15.78%。隨著接種量的增加，水解度趨于平穩(wěn)，而多肽得率呈現(xiàn)了下降趨勢。這可能是因為接種量太小，微生物菌體數(shù)目過少，導(dǎo)致蛋白質(zhì)底物不能被微生物完全水解；而接種量過大時，微生物會優(yōu)先利用小分子肽用于自身的生長發(fā)育，造成肽含量的降低。經(jīng)綜合分析，選取接種量10%、12.5%、15%這 3個水平用于正交試驗。

2.1.3 水分含量對水解度和多肽得率的影響

水分含量對水解度和多肽得率的影響如圖4所示。由圖4可知，隨著水分含量的增加，榛仁粕的水解度和多肽得率均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在水分含量為50%時水解度達(dá)到最大值25.59%；水分含量為60%時多肽得率達(dá)到最大值16.55%。之后，隨著水分含量的增加，榛仁粕的水解度和多肽得率均有所降低。這可能是因為接入的枯草芽孢桿菌和米曲霉均是好氧微生物，在微生物生長發(fā)育和繁殖時期均需要一定的水分參加生理反應(yīng)。水分含量較低時，不利于微生物生長、酶生產(chǎn)及酶水解過程；水分含量過高時，會使固體培養(yǎng)基變?yōu)楹隣?，透氣性差，不利于微生物的繁殖，甚至?dǎo)致微生物的死亡。經(jīng)綜合分析，選取水分含量40%、50%、60% 這3個水平用于正交試驗。

圖4 水分含量對水解度和多肽得率的影響Fig.4 Effects of water content on hydrolysis degree and polypeptide yield

2.1.4 發(fā)酵溫度對水解度和多肽得率的影響

發(fā)酵溫度對水解度和多肽得率的影響如圖5所示。由圖5可以發(fā)現(xiàn)，榛仁粕水解度和多肽得率在28～31 ℃呈下降趨勢，在31～37 ℃呈上升趨勢，并在37 ℃達(dá)到最大值，分別為23.58%和15.90%。高于37 ℃時再次呈現(xiàn)下降趨勢。這可能是由于28 ℃和37 ℃分別為米曲霉和枯草芽孢桿菌的最適生長溫度，在最適溫度下微生物可以快速生長繁殖。當(dāng)發(fā)酵溫度在31 ℃時偏離2種菌的最適發(fā)酵溫度，微生物不能快速恢復(fù)生長，因此水解度和多肽得率均呈現(xiàn)降低的趨勢。而隨著發(fā)酵溫度的升高，接近菌種的最適生長溫度，水解度和多肽得率又呈現(xiàn)上升趨勢，直至再次超過菌種的最適溫度。經(jīng)綜合分析，選取發(fā)酵溫度34、37、40 ℃ 這3個水平用于正交試驗。

圖5 發(fā)酵溫度對水解度和多肽得率的影響Fig.5 Effects of fermentation temperature of hydrolysis degree and polypeptide yield

2.2 正交試驗

根據(jù)以上各單因素試驗結(jié)果確定的正交試驗設(shè)計及試驗結(jié)果如表1所示。根據(jù)表1中極差分析結(jié)果可知，以水解度為指標(biāo)的影響程度由高到低依次為菌種比例（A）、水分含量（D）、發(fā)酵溫度（C）、接種量（B），得到的最佳發(fā)酵組合為A1B3C3D3，即菌種比例1∶1，接種量15%，發(fā)酵溫度40 ℃，水分含量60%。以多肽得率為指標(biāo)的影響程度由高到低依次為菌種比例（A）、水分含量（D）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C），得到的最佳發(fā)酵組合為A1B1C3D3，即菌種比例1∶1，接種量10%，發(fā)酵溫度40 ℃，水分含量60%。

由2個考察指標(biāo)所得的最佳工藝條件除因素B即接種量外均一致，通過綜合平衡法可知接種量對于水解度的增加量大于對多肽得率的增加量，因此選擇A1B3C3D3為最佳發(fā)酵組合。在此最佳組合條件下，進(jìn)行正交驗證試驗，在發(fā)酵時間為48 h時，水解度為27.91%，多肽得率為18.77%。

2.3 發(fā)酵時間對水解度和多肽得率的影響

發(fā)酵時間對水解度和多肽得率的影響如圖6所示。由圖6可以發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵時間的延長，榛仁肽的水解度一直處于上升趨勢，此時菌體仍在生長繁殖，不斷產(chǎn)生蛋白酶，酶解榛仁蛋白，在發(fā)酵48 h后多肽得率達(dá)到最大值18.77%，之后隨著發(fā)酵時間的增加呈下降趨勢，其原因可能是當(dāng)微生物積累到一定數(shù)量時，需要部分榛仁蛋白用于生長繁殖，大分子蛋白尚未被水解，所以微生物會優(yōu)先利用分子量小的多肽，因此出現(xiàn)下降的趨勢。若繼續(xù)發(fā)酵下去肽類物質(zhì)可能迅速減少，因此最佳發(fā)酵時間應(yīng)選擇48 h。

表1 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table1 Orthogonal experiment design and experiment results

圖6 發(fā)酵時間對水解度和多肽得率的影響Fig.6 Effects of fermentation time on hydrolysis degree and polypeptide yield

2.4 不同發(fā)酵時間榛仁肽體外抗氧化活性測定

還原力的測定、DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基清除活性是評價多肽體外抗氧化活性的常用方法[18-19]。發(fā)酵時間對榛仁肽體外抗氧化活性的影響如圖7～10所示。由圖7可以發(fā)現(xiàn)，總還原力隨著發(fā)酵時間的增加而顯著增加（P＜0.05）。在發(fā)酵時間為48 h時，總還原力達(dá)到最高0.935。與發(fā)酵0 h的樣品相比，經(jīng)過固態(tài)發(fā)酵的榛仁粕的還原力顯著增強(qiáng)。由圖8～10可以看出，不同發(fā)酵時間下產(chǎn)物對不同自由基均有較強(qiáng)的清除效果，發(fā)酵36 h后的榛仁肽對DPPH自由基和羥基自由基清除率達(dá)到最大值，分別為94.51%和63.88%。隨著發(fā)酵時間的延長，清除率趨于穩(wěn)定。發(fā)酵48 h后的榛仁肽對超氧陰離子自由基清除率達(dá)到98.75%，隨后清除能力變化緩慢。與發(fā)酵0 h的樣品相比，發(fā)酵后的樣品各自由基清除率均顯著增加。這是因為還原能力與水解后的蛋白結(jié)構(gòu)及其肽鏈斷裂的位置有一定的相關(guān)性，水解后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，產(chǎn)生一些具有一定抗氧化性的多肽[20]。隨著發(fā)酵時間的增加，蛋白質(zhì)的水解度逐漸增加，所以樣品的抗氧化性指標(biāo)均顯著增加。

圖7 發(fā)酵時間對總還原力的影響Fig.7 Effect of fermentation time on total reducing force

圖8 發(fā)酵時間對DPPH·清除率的影響Fig.8 Effect of fermentation time on DPPH· scavenging rate

圖9 發(fā)酵時間對OH·清除率的影響Fig.9 Effect of fermentation time on OH· scavenging rate

圖10 發(fā)酵時間對O2-·清除率的影響Fig.10 Effect of fermentation time on O2-· scavenging rate

2.5 不同發(fā)酵時間榛仁肽體外降血壓活性測定

發(fā)酵時間對榛仁肽體外降血壓活性的影響如圖11所示。由圖11可以看出，隨著發(fā)酵時間的增加ACE抑制率顯著增加（P＜0.05）。在發(fā)酵時間為60 h時，ACE抑制率達(dá)到25.28%?？梢灶A(yù)測隨著發(fā)酵時間的延長，長鏈肽繼續(xù)被水解為短肽，而ACE抑制肽多為相對分子質(zhì)量不大于3 000 kD的多肽[21]，發(fā)酵產(chǎn)物的ACE抑制率還會繼續(xù)上升。由此看出，發(fā)酵產(chǎn)物具有一定的體外降血壓活性。

圖11 發(fā)酵時間對ACE抑制率的影響Fig.11 Effects of fermentation time on ACE inhibition rate

3 結(jié)論與討論

以枯草芽孢桿菌和米曲霉為發(fā)酵菌株，采用固態(tài)發(fā)酵的方法，制備榛仁活性肽。通過單因素試驗和正交試驗得到固態(tài)發(fā)酵最佳工藝為：菌種比例1∶1，接種量15%，發(fā)酵溫度40 ℃，水分含量60%。在此條件下發(fā)酵48 h的產(chǎn)物水解度及多肽得率可達(dá)最高，分別為27.91%和18.77%。對不同發(fā)酵時間的活性肽進(jìn)行體外抗氧化活性和降血壓活性評價，結(jié)果表明發(fā)酵48 h后的產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗氧化性，尤其是對DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除能力分別可以達(dá)到94.51%和98.75%。發(fā)酵60 h的產(chǎn)物的ACE抑制率可達(dá)25.28%，而且可能隨著發(fā)酵時間的延長其ACE抑制率會繼續(xù)提高。

本試驗中僅研究了少量榛仁粕固態(tài)發(fā)酵的情況，具有一定的局限性，應(yīng)進(jìn)一步研究大批量榛仁粕固態(tài)發(fā)酵情況，從而為其工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。另外榛仁肽是一種天然活性肽，有待于進(jìn)一步分離純化，并對其生物活性進(jìn)行深入研究。

[1] 王成達(dá),王秀云,張來春.榛子生長特性及其研究利用現(xiàn)狀[J].林業(yè)勘查設(shè)計,2009(4):83-84.

[2] 侯智霞,原牡丹,劉雪梅,等.我國榛子生產(chǎn)研究概況[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2008,26(2):123-126.

[3] 王 晶.榛仁肽的制備及特性研究[D].長春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

[4] 武萬興,陳朝銀,趙聲蘭,等.固態(tài)發(fā)酵核桃粕制備活性肽及其抗氧化活性的研究[J].食品工業(yè)科技,2013,34(16):266-271.

[5] 王明爽,閔偉紅,沈明浩,等.長白山榛仁(Corylus heterophylla Fisch)蛋白酶解物對小鼠免疫功能的影響[J]. 現(xiàn)代食品科技,2016,32(2):1-6,45.

[6] 管 瑛,汪瑨芃,李 文,等.豆渣固態(tài)發(fā)酵過程中主要營養(yǎng)成分及抗氧化特性變化[J].食品科學(xué),2016,37(21):189-194.

[7] 馬 力,陳永忠,彭邵鋒,等.油茶粕最優(yōu)培養(yǎng)基及混菌生產(chǎn)蛋白飼料的研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,2013,33(10):34-37.

[8] 柳 杰,張 暉,郭曉娜,等.液態(tài)發(fā)酵制備花生抗氧化肽的優(yōu)化研究[J].中國油脂,2011,36(2):25-30.

[9] 趙新淮,馮志彪.大豆蛋白水解物水解度測定的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1995,26(2):178-181.

[10] 包怡紅,于陽陽,趙若詩.酶解山核桃蛋白制備降血壓肽的工藝[J].食品科學(xué),2013,34(1):220-224.

[11] 魯 偉,任國譜,宋俊梅.蛋白水解液中多肽含量的測定方法[J].食品科學(xué),2005,26(7):169-171.

[12] 鞠興榮,王雪峰,王立峰,等.混菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕制備菜籽肽的菌種篩選[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2011,37(9):104-108.

[13] Kaur R, Arora S, Singh B. Antioxidant activity of the phenol rich fractions of leaves of Chukrasia tabularis A Juss [J]. Bioresource Technology, 2008, 99(16):7692-7698.

[14] 彭 昕,黃 亮,王 平,等.雷竹筍總黃酮和總甾醇的抗氧化性與抑菌性[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2017,35(3):179-185.

[15] 包怡紅,王 芳,王文瓊.大豆多肽硒螯合物的制備及抗氧化活性分析[J].食品科學(xué),2013,34(16):27-32.

[16] 裴 斐,陶虹伶,蔡麗娟,等.響應(yīng)面試驗優(yōu)化辣木葉多酚超聲輔助提取工藝及其抗氧化活性[J].食品科學(xué),2016, 37(20):24-30.

[17] 黎觀紅.食物蛋白源血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的研究[D].無錫:江南大學(xué),2005.

[18] 侯雅坤,王 晟,黃 昆,等.核桃蛋白酶解工藝優(yōu)化與酶解液抗氧化活性分析[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2012,38(4):99-103.

[19] 張友維.枯草芽孢桿菌發(fā)酵花生粕制備抗氧化肽的研究[D].無錫:江南大學(xué),2012.

[20] KONG BH, XIONG YL. Hydroxyl radical-stressed whey protein isolate: Functional and rheological properties[J]. Food and Bioprocess Technology, 2013, 16(1): 169-176.

[21] 王曉丹,薛 璐,胡志和,等. ACE抑制肽構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2017,38(5):305-310.