鄧愛華 ，李紅勇 ，謝 鵬 ，王 云 ，彭才旺 ，程麗楠

（1.湖南文理學(xué)院 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 常德 415000；2.湖南人文科技學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，湖南 婁底 417000）

杜仲Eucommia ulmoides Oliv為杜仲科落葉喬木，是我國(guó)特有經(jīng)濟(jì)植物，主要分布于湘、桂、川、滇及長(zhǎng)江中下游流域等[1-2]。據(jù)《本草綱目》記載，杜仲皮為名貴滋補(bǔ)藥材，而杜仲樹剝皮后容易死亡，制約了杜仲的藥用價(jià)值推廣[3]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，杜仲葉與杜仲皮具有相同的功能成分和藥理功效，杜仲葉中活性成分綠原酸含量高達(dá)5%，且富含京尼平苷、桃葉珊瑚苷等[4-5]。綠原酸具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、保護(hù)心血管和清除體內(nèi)自由基等作用[6-7]，對(duì)治療血液、消化及生殖系統(tǒng)等方面的疾病有顯著效果[8]。因此，杜仲中綠原酸的提取開發(fā)成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)[9-11]。

綠原酸屬于極性有機(jī)酸，一般采用極性較強(qiáng)的水提取杜仲葉中綠原酸[12-13]。然而，綠原酸在強(qiáng)極性溶劑和高溫下容易發(fā)生水解和分子內(nèi)酯基遷移現(xiàn)象[14]，從而異構(gòu)化形成新綠原酸和隱綠原酸，導(dǎo)致新綠原酸和隱綠原酸含量升高，綠原酸含量下降。為了強(qiáng)化提取效率和縮短提取時(shí)間，研究人員采用微波輔助提取法[15]、超聲波輔助提取法[16]和生物酶法[17]等進(jìn)行提取，這些方法在一定程度上改善了提取效果，但由于設(shè)備投資大，運(yùn)行成本高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。除此之外，采用水提取法所提取綠原酸的雜質(zhì)較多，加大了后續(xù)分離的成本。為此，有人嘗試用極性適中的有機(jī)溶劑提取法，有機(jī)溶劑能夠抑制植物酶對(duì)綠原酸的催化分解作用，減少水溶性雜質(zhì)的溶出[18]。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，綠原酸在乙醇體系中比在甲醇、丙酮等有機(jī)體系中更加穩(wěn)定，乙醇成為提取綠原酸的首選溶劑[19]。傳統(tǒng)的單因素和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)誤差較大，已不能滿足杜仲葉的綠原酸提取工藝優(yōu)化要求[20-21]，基于數(shù)學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)合的響應(yīng)面分析法不僅能夠縮短優(yōu)化時(shí)間，而且建模速度快，工程應(yīng)用的可信度高[22]。為此，本文中以乙醇水溶液作為提取溶劑，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法分析乙醇濃度、料液比、提取溫度等工藝參數(shù)對(duì)杜仲葉中綠原酸提取率的影響，旨在為優(yōu)化杜仲葉綠原酸的提取工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

杜仲葉（湖南廣源生物科技有限公司），綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（北京盛世康普化工技術(shù)研究院），其他試劑為分析純（國(guó)藥集團(tuán)）。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

UV-5100型紫外分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司），BT25S型電子天平（賽多利斯有限公司），101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），F(xiàn)W135型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司），TDL-40B型高速離心機(jī)（上海安寧科學(xué)儀器廠），HWS-12型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒儀器有限公司）。

1.2 方 法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

參考相關(guān)文獻(xiàn)[23]，精密稱取10.4 mg的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，用40%乙醇溶液定容至10 mL，配制1.04 mg/mL的母液，再將母液分別稀釋成5.2、10.4、15.6、20.8、31.2、41.6 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)溶液在325、345 nm的A325、A345值，求得ΔA。以吸光度ΔA為橫坐標(biāo)，綠原酸濃度C為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，C＝47.281 0ΔA－0.510 5，R2＝0.999 3，說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)曲線線型相關(guān)性良好。

1.2.2 樣品檢測(cè)

將杜仲葉在鼓風(fēng)干燥機(jī)中烘干后粉碎，過(guò)篩，稱取粉碎后的樣品20.0 g置于500 mL燒杯中，加入280 mL 40%的乙醇水溶液，放于60 ℃恒溫水浴鍋中回流提取30 min后，濾液真空抽濾，然后將提取液5 000 r/min離心5 min，取上清液稀釋50倍。以40%乙醇溶液為參比，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A325、A345值，求出提取液中的綠原酸含量。

1.2.3 穩(wěn)定性測(cè)定

將待測(cè)樣品置于室溫下24 h，再進(jìn)行吸光度測(cè)定，結(jié)果見表1。由表1可知，各樣品在40%乙醇溶液中的吸光度值變化不大，說(shuō)明各樣品在40%乙醇溶液中表現(xiàn)穩(wěn)定。

表1 樣品放置24 h后吸光度變化Table1 Changes of absorbances of placed samples after 24 h

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

稱取20.0 g杜仲葉粉末加入500 mL三頸燒瓶中，然后加入一定濃度的乙醇水溶液，加熱至設(shè)定溫度，回流提取一定的時(shí)間后，按照1.2.2方法檢測(cè)提取液中綠原酸含量，分別考察乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（10%、20%、40%、60%、80%、100%）、 溫度（30、50、60、70、80、90 ℃）、時(shí)間（30、45、60、75、90、105 min）、料液比（1∶ 6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16）以及提取次數(shù)等因素對(duì)綠原酸提取率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定料液比、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取溫度3個(gè)因素及水平值，運(yùn)用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。料液比、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、溫度分別以A、B、C表示，每個(gè)因素的高中低水平分別以1、0、-1進(jìn)行編碼，各試驗(yàn)因素及水平值見表2。

表2 試驗(yàn)因素及水平Table2 Factors and levels of experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)綠原酸提取率的影響

在料液比1∶14、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間30 min條件下，考察不同乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)綠原酸提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增高，綠原酸的提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)，選擇40%乙醇作為提取溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖1 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol mass fraction on extraction rate of chlorogenic acid

2.1.2 提取溫度對(duì)綠原酸提取率的影響

在料液比1∶14、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%、提取時(shí)間30 min條件下，考察提取溫度對(duì)綠原酸提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在30～60 ℃之間，綠原酸提取率隨著溫度的升高而增加，達(dá)到60 ℃后，隨著溫度的進(jìn)一步升高，綠原酸的提取率呈緩慢下降趨勢(shì)。綠原酸為熱敏性物質(zhì)，在高溫下容易失去活性，所以適宜的提取溫度為60 ℃。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響

在料液比1∶14、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%、提取溫度60 ℃條件下，考察提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，綠原酸的提取率隨著提取時(shí)間的增加而迅速增長(zhǎng)，60 min時(shí)提取率最高，之后隨著提取時(shí)間的增加提取率迅速降低，可能是隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，部分綠原酸在高溫下分解。因此，選擇提取時(shí)間60 min。

圖2 提取溫度對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of chlorogenic acid

圖3 提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.3 Effect of extraction duration on extraction rate of chlorogenic acid

2.1.4 料液比對(duì)綠原酸提取率的影響

在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%、提取時(shí)間60 min、提取溫度60 ℃條件下，考察料液比對(duì)綠原酸提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，綠原酸的提取率隨著料液比的增加而不斷上升，當(dāng)料液比為1∶14時(shí)提取率最大，隨后趨于平穩(wěn)。

2.1.5 提取次數(shù)對(duì)綠原酸提取率的影響

圖4 料液比對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of chlorogenic acid

取杜仲葉粉20.0 g，在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%、溫度為60 ℃、料液比為1∶14的條件下提取60 min，并提取4次，如圖5所示，綠原酸的提取率在2次提取后趨于穩(wěn)定，所以選擇2次作為提取次數(shù)。

圖5 提取次數(shù)對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.5 Effect of extraction times on extraction rate of chlorogenic acid

2.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)值結(jié)果及其擬合模型

采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定液料比1∶14，提取次數(shù)2次，分析乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table3 Design and results of the response surface experiment

2.2.2 模型方程的建立及顯著性分析

利用Design-Expert 8.0 Trial軟件對(duì)表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得表4。

表4 回歸模型及其顯著性檢驗(yàn)Table4 Test of the regression model and its signiciances

當(dāng)P值小于0.05時(shí)，表示此項(xiàng)指標(biāo)顯著，說(shuō)明自變量和響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著。各因素經(jīng)回歸擬合后，得回歸方程：

其中，Y為提取率，A為料液比，B為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)，C為溫度。

由方差分析結(jié)果可知，該回歸方程呈極顯著性（P＜0.01），模型失擬項(xiàng)也呈極顯著性（P＜0.01）。B、C2對(duì)綠原酸提取率的影響極顯著（P＜0.01），B2對(duì)綠原酸提取率的影響顯著（P＜0.05），A、C、AB、AC、BC、A2對(duì)綠原酸提取率的影響不顯著（P＞0.05）。

2.2.3 響應(yīng)曲面分析

根據(jù)回歸分析結(jié)果，做出響應(yīng)面圖，如圖6～8所示。由圖6可知，在各料液比中，隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，綠原酸的提取率開始快速增加而后減緩。由圖7可知，在各料液比中，隨著提取溫度的增加，綠原酸的提取率先上升后下降，可能是由于綠原酸為熱敏性物質(zhì)，隨著溫度的升高綠原酸分解，從而導(dǎo)致提取率下降。由圖8可知，在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)，隨著溫度的增加綠原酸的提取率先上升后下降；在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大為40%～60%時(shí)，提取率達(dá)最大；隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步增加，持續(xù)提高溫度，提取率下降。

圖6 料液比和乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.6 Effect of solid-liquid ratio and ethanol mass fraction on extraction rate of chlorogenic acid

圖7 料液比和提取溫度對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.7 Effect of solid-liquid ratio and extraction temperature on extraction rate of chlorogenic acid

圖8 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和提取溫度對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.8 Effect of ethanol mass fraction and extraction temperature on extraction rate of chlorogenic acid

2.2.4 提取工藝條件檢驗(yàn)

考慮到實(shí)際情況，將提取工藝條件修改為料液比1∶11，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%，提取溫度61 ℃。采用修正條件進(jìn)行試驗(yàn)，得綠原酸實(shí)際提取率為0.870 8%，與0.872 8%相比，相差0.23%，說(shuō)明此方程與實(shí)際情況擬合良好，所建模型可靠。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化杜仲葉中綠原酸的提取工藝，獲得最佳提取條件：料液比1∶11、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%、提取溫度61.42 ℃。在此工藝條件下綠原酸提取率為0.872 8%。3個(gè)工藝條件對(duì)綠原酸提取率影響程度由大到小依次為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度?？紤]到實(shí)際操作的限制，將提取工藝條件參數(shù)修改為料液比1∶11，乙醇濃度40%，提取溫度61 ℃。采用修正條件進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果與理論預(yù)測(cè)值基本一致。

為了進(jìn)一步提高杜仲葉中綠原酸的提取效率，除了微波和超聲波輔助外，還可以通過(guò)一些生物技術(shù)來(lái)改善提取效果。如陳曉娟等[24]分別通過(guò)酶法和半仿生法從杜仲葉中提取綠原酸，提取率達(dá)到1.44%和1.29%；劉藝等[25]通過(guò)超臨界流體萃取綠原酸，避免了提取過(guò)程中高溫氧化分解綠原酸；余少?zèng)_等[26]采用罐組動(dòng)態(tài)逆流提取技術(shù)提取綠原酸，提取率是傳統(tǒng)單罐提取的2.3倍。溫度對(duì)綠原酸的穩(wěn)定性和提取效率起到雙重影響的作用，一方面，溫度的維持不利于綠原酸的穩(wěn)定，另外一方面，升高溫度有利于提高綠原酸的表觀活化能，加快綠原酸擴(kuò)散至杜仲葉顆粒表面，增加其在溶劑中的溶解度，進(jìn)而提高綠原酸提取率[27]。因此，還需進(jìn)一步探討溫度和乙醇對(duì)綠原酸的浸出動(dòng)力學(xué)原理，綠原酸粗提工藝也需要向精提工藝轉(zhuǎn)變。

[1] 魏艷秀,劉慧東,杜紅巖,等.外源激素提高杜仲葉中有效成分含量的效果[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2017,37(5):42-49.

[2] 馮 攀.杜仲葉中綠原酸提取純化綠色工藝的研究[D].西安:陜西科技大學(xué),2014.

[3] 朱周靚, 嚴(yán) 峻, 鄭云燕, 等.杜仲葉安全性的毒理學(xué)評(píng)價(jià)[J].浙江預(yù)防醫(yī)學(xué),2017,29(5):443-448.

[4] 楊 凌,張正香,莫開林,等.不同影響因素下杜仲葉中綠原酸含量變化特征研究[J].四川林業(yè)科技,2012,33(1):50-52.

[5] 杜笑林,朱高浦,閆文德,等.基于葉、皮、材兼用的高密度杜仲栽培模式研究[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2016,34(3):1-7.

[6] 賴玲林,肖 苑,彭小芳.杜仲葉綠原酸提取物聯(lián)合西紅花苷對(duì)肝癌細(xì)胞膽固醇代謝的影響[J].山東醫(yī)藥,2017,57(8):17-20.

[7] 王學(xué)軍,梁旭華,徐 恒. HPLC法同時(shí)測(cè)定杜仲葉中4種成分的含量[J].中醫(yī)藥信息,2017,34(1):33-35.

[8] 相 俊,卞崔冬,萬(wàn)曉東,等.杜仲葉提取物對(duì)人精子膜功能損傷的保護(hù)作用[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2017,38(3):46-49.

[9] 孫 陽(yáng),黃 和,胡 燚.綠原酸提取純化方法的研究進(jìn)展[J].化學(xué)試劑,2017,39(3):257-262.

[10] 張小斌,陳書存,雷燕妮.商洛杜仲葉中綠原酸的提取工藝優(yōu)選研究[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,62(3):34-39.

[11] 項(xiàng)麗玲,溫亞娟,苗明三.杜仲葉的化學(xué)、藥理及臨床應(yīng)用分析[J].中醫(yī)學(xué)報(bào),2017,32(1):99-102.

[12] 魏 銳,田惠玲,周建軍,等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化杜仲葉中綠原酸水提工藝[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(7):3965-3967.

[13] 張吉波,孔 麗,于海輝.杜仲葉中綠原酸水提工藝的優(yōu)化及其防腐效果研究[J].食品科技,2013,38(4):232-236.

[14] Nichiforescu E, Coucou V. On the distribution of odihydroxyphenols of the caffeic acid type in the artichoke leaves and on their variation as a function of temperature[J]. Annales Pharmaceutiques Francaises, 1966, 24(2): 127-132.

[15] 邵 平,洪 臺(tái),劉青梅,等.杜仲葉綠原酸的微波提取及高速逆流色譜分離純化[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2011,25(4):760-767.

[16] 岳 鹍,王 芃,崔榮健.超聲波輔助提取杜仲葉中綠原酸的工藝研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊),2010(2): 33-35.

[17] 張雪梅,謝金芮,陳玉甫,等.全酶解法提取杜仲葉中綠原酸及其含量測(cè)定[J].中國(guó)釀造,2016,35(10):149-152.

[18] 李進(jìn)飛.杜仲葉中綠原酸的提取及動(dòng)力學(xué)研究[D].長(zhǎng)沙:中南大學(xué),2004.

[19] 楊小峰.乙醇回流法提取蘋果中綠原酸的工藝研究[J].河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2017,33(3):6-11.

[20] 張 蕾,張 娜,展雯琳.正交法優(yōu)選杜仲葉中綠原酸提取工藝[J].糧食流通技術(shù),2016(14):97-100.

[21] 馮慧娟,吳利強(qiáng),周海玲,等.正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化金銀花中綠原酸的提取工藝[J].廣東化工,2017,44(8):53-54,3.

[22] 韓建軍,寧 娜,郁建生,等.響應(yīng)面法優(yōu)化微波協(xié)同酶法提取杜仲葉中綠原酸的工藝[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(8):227-231.

[23] 孫 波,彭密軍,于華忠,等.紫外可見分光光度法測(cè)定杜仲綠原酸含量的方法研究[J].中國(guó)野生植物資源,1999,18(3):54-55.

[24] 陳曉娟,周春山.酶法及半仿生法提取杜仲葉中綠原酸和黃酮[J].精細(xì)化工,2006,23(3):257-260.

[25] 劉 藝,李云淼,馮偉博.提取工藝對(duì)色譜法檢測(cè)蘆薈葉多酚含量的影響[J].食品工業(yè),2017,38(5):300-303.

[26] 余少?zèng)_,楊祖金,袁雨婕,等.罐組動(dòng)態(tài)逆流提取中藥杜仲葉中總黃酮和綠原酸的研究[J].中藥材,2009,32(2):300-302.

[27] 谷楠楠,王天貴,肖清貴,等.杜仲葉中綠原酸的浸出動(dòng)力學(xué)[J].過(guò)程工程學(xué)報(bào),2016,16(4):590-595.