周傳江， 顧錢(qián)洪， 孟曉林， 李斌順， 趙文武， 龐顯炳， 張建新， 宋東鎣， 聶國(guó)興*

(1. 河南省水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453007；2.林州市水產(chǎn)站，河南林州456550； 3. 安陽(yáng)市水產(chǎn)科學(xué)研究所，河南安陽(yáng)455000)

中華多刺魚(yú)Pungitiussinensis隸屬于刺魚(yú)目Gasterosteiformes刺魚(yú)科Gasterosteidae多刺魚(yú)屬Pungitius。關(guān)于該屬及近緣種的研究涉及到種群、生態(tài)學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育、進(jìn)化生物學(xué)等方面(Chae，1988；Chae & Yang，1988，1993；Takahashi & Goto，2001；Watanabeetal.，2003；Koizumietal.，2007；卞紹雷等，2008；Hubertetal.，2008；Kietal.，2008；Aldenhovenetal.，2010；Shikanoetal.，2010；Teacheretal.，2011；Hwangetal.，2012；McCuskeretal.，2013；Geigeretal.，2014；Denysetal.，2015；Rezansoffetal.，2015；Thalingeretal.，2016)。據(jù)資料記載，我國(guó)有4種刺魚(yú)分布，即刺魚(yú)屬Gastersteus的三刺魚(yú)Gastersteusaculeatus(鄭葆珊等，1980；成慶泰，周才武，1997)和多刺魚(yú)屬的中華多刺魚(yú)P.sinensis、刺魚(yú)P.pungitius(即八棘多刺魚(yú)；任慕蓮等，1981)、多刺魚(yú)P.pungitiussinensis(尼科爾斯基，1960)。中華多刺魚(yú)在我國(guó)北方分布廣泛，如黑龍江(尼科爾斯基，1960；任慕蓮，1981；張覺(jué)民，1995)、圖們江(鄭葆珊等，1980)、北京(王鴻媛，1984)、遼寧(劉嬋馨，秦克靜，1987)、天津(天津市水產(chǎn)學(xué)會(huì)，1990；李明德，2011)、河北(李明德，楊竹舫，1992；王所安等，2000)、山東(成慶泰，周才武，1997)?！吨袊?guó)魚(yú)類系統(tǒng)檢索》(成慶泰，鄭葆珊，1987)中記錄中華多刺魚(yú)在黑龍江、松花江、圖們江、遼河、內(nèi)蒙古、河北及長(zhǎng)江流域有分布，但《長(zhǎng)江魚(yú)類》(湖北省水生生物研究所魚(yú)類研究室，1976)中并沒(méi)有記錄該種，所以卞紹雷等(2008)認(rèn)為北京及其周邊地區(qū)可能為中華多刺魚(yú)在亞洲大陸的最南分布點(diǎn)。2015年10月，河南省魚(yú)類資源調(diào)查隊(duì)在河南省林州市進(jìn)行魚(yú)類資源普查時(shí)，采集到30尾刺魚(yú)目魚(yú)類，綜合采用形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)的方法確定其為中華多刺魚(yú)，本種系河南省新紀(jì)錄種，標(biāo)本保存于河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院魚(yú)類標(biāo)本室。本文初步分析了該魚(yú)的主要鑒定特征、在河南省的分布區(qū)域、可能來(lái)源、生存環(huán)境等。

1 材料與方法

1.1 材料

30尾實(shí)驗(yàn)魚(yú)均采自河南省林州市五龍鎮(zhèn)河頭村河頭大橋(113°56′27.89″E，35°50′14.59″N)，地籠誘捕獲得，13尾100%乙醇和17尾10%甲醛溶液整體固定，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測(cè)量和后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 形態(tài)測(cè)量

對(duì)17尾甲醛溶液固定標(biāo)本用數(shù)顯游標(biāo)卡尺(單位：mm)測(cè)量全長(zhǎng)、體長(zhǎng)、頭長(zhǎng)、眼徑、吻長(zhǎng)、眼后頭長(zhǎng)、吻寬、體高、尾柄長(zhǎng)、尾柄高、吻至背鰭長(zhǎng)、第一背鰭長(zhǎng)、第二背鰭長(zhǎng)、背鰭高、臀鰭基長(zhǎng)、臀鰭高、胸鰭基長(zhǎng)、腹鰭基長(zhǎng)，并計(jì)數(shù)背鰭棘數(shù)目、臀鰭和胸鰭鰭條數(shù)目及棘數(shù)。

1.3 分子生物學(xué)及分子系統(tǒng)學(xué)方法鑒定

1.3.1基因組DNA提取取適量經(jīng)酒精固定的標(biāo)本背部肌肉組織置于1.5 mL離心管中，55 ℃烘干4 h后采用酚-氯仿提取法提取基因組DNA(薩姆布魯克，拉塞爾，2008)。

1.3.2PCR擴(kuò)增獲得目的基因PCR擴(kuò)增線粒體COⅠ基因的引物對(duì)為HCO：5’-AAACYTCWGGGTGVCCAAAGAAYC-3’，LCO：5’-TACTAAYCACAAAGATATTGGCAC-3’(Folmeretal.，1994)。30 μL PCR反應(yīng)體系包含：15 μL mix，上、下游引物各1 μL，基因組DNA 1 μL，滅菌水12 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物分別用上、下游引物測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

從測(cè)序公司返回的測(cè)序結(jié)果為峰圖文件，采用DNASTAR的Seqman組裝為一個(gè)contig，通過(guò)NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST分析(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，確認(rèn)為目的基因COⅠ，同時(shí)從NCBI下載刺魚(yú)目及其近緣種的COⅠ基因序列共71條(表1)，用MEGA 7.0(Kumaretal.，2016)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和計(jì)算遺傳距離。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建采用NJ原理Kimura雙參法，1 000個(gè)重復(fù)抽樣，其他參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置。遺傳距離估算依據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)將同種的分為同一個(gè)群，之后分別計(jì)算群內(nèi)和群間的遺傳距離，進(jìn)而對(duì)這些序列及物種之間的關(guān)系進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)分析結(jié)果

形態(tài)鑒定30尾，均符合中華多刺魚(yú)的主要鑒別特征：眼較大，體長(zhǎng)，呈側(cè)扁形，尾柄極細(xì)，有明顯側(cè)棱。側(cè)線上有31～33個(gè)骨板，尾截形或微凹入(圖版Ⅰ：1)，具2個(gè)背鰭，第一背鰭為游離的棘，具有交錯(cuò)排列的8～9個(gè)棘(圖版Ⅰ：2)，第二背鰭和臀鰭相對(duì)，8～10個(gè)鰭條，臀鰭具1棘8～10個(gè)鰭條，胸鰭為8～9個(gè)鰭條，腹鰭為1棘1～2個(gè)鰭條(圖版Ⅰ：3)。形態(tài)測(cè)量顯示(n=17)：全長(zhǎng)49.22±3.90，體長(zhǎng)41.79±5.57，頭長(zhǎng)11.85±1.35，眼徑3.57±0.47，吻長(zhǎng)3.02±0.70，眼后頭長(zhǎng)5.83±0.88，尾柄長(zhǎng)7.18±0.80，尾柄高1.34±0.16，吻至背鰭長(zhǎng)13.28±0.99，第一背鰭長(zhǎng)13.67±1.64，第二背鰭長(zhǎng)10.50±1.31，背鰭高4.33±0.87，臀鰭基長(zhǎng)10.47±1.16，臀鰭高4.75±0.57，胸鰭基長(zhǎng)2.48±0.30，腹鰭基長(zhǎng)6.93±0.72。體長(zhǎng)為體高的4.4～6.9倍，為頭長(zhǎng)的3.0～4.5倍。頭長(zhǎng)為吻長(zhǎng)的2.4～6.2倍，為眼徑的2.5～4.0倍，為尾柄長(zhǎng)的1.2～2.0倍，為尾柄高的7.0～12.0倍，尾柄長(zhǎng)為尾柄高的4.3～7.3倍。

圖版Ⅰ 中華多刺魚(yú)的主要鑒別特征及生境Plate Ⅰ The main diagnostic characteristics and habitat of Pungitius sinensis

1.中華多刺魚(yú)整體； 2. 第一背鰭的棘(白色箭頭所指)和第二背鰭(黃色箭頭所指)； 3. 腹鰭及臀鰭的棘(白色箭頭所指)和骨板(黃色箭頭所指)； 4. 中華多刺魚(yú)生活水體環(huán)境； 比例尺=1 cm

1. Whole body ofP.sinensis； 2. Spines of first dorsal fin (white arrow) and the second dorsal fin (yellow arrow)； 3. Spines of ventral fin and anal fin (white arrow) and bone plate (yellow arrow)； 4. Living water environment ofP.sinensis； scale bar=1 cm

2.2 分子生物學(xué)及分子系統(tǒng)學(xué)結(jié)果

PCR擴(kuò)增共獲得中華多刺魚(yú)線粒體COⅠ基因序列10條，與NCBI下載的刺魚(yú)目及近緣種的61條COⅠ基因序列一起比對(duì)后發(fā)現(xiàn)：589 bp序列中保守位點(diǎn)448個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)133個(gè)，T、C、A、G含量分別為28.4%、30.2%、23.6%、17.8%，A+T含量高于G+C含量。71條序列構(gòu)建的NJ樹(shù)顯示(圖1)，外群聚為單獨(dú)的一支，多刺魚(yú)屬構(gòu)成支持率為100%的單系類群，但各支情況有所不同，圖們江多刺魚(yú)P.tymensis位于多刺魚(yú)屬的基部。光身多刺魚(yú)P.laevis、本研究的中華多刺魚(yú)、沼澤多刺魚(yú)P.hellenicus、平腹多刺魚(yú)P.platygaster的所有個(gè)體均聚在一起構(gòu)成高支持率的單系。而廣布種八棘多刺魚(yú)則分為多個(gè)分支，可能因其分布范圍較廣，不同區(qū)域的種群已經(jīng)發(fā)生了分化。

同種魚(yú)的群內(nèi)遺傳距離為0～0.006(如八棘多刺魚(yú)為0.006、僅有一個(gè)個(gè)體的圖們江多刺魚(yú)無(wú)法計(jì)算、光身多刺魚(yú)為0.002、沼澤多刺魚(yú)為0、平腹多刺魚(yú)為0.001、中華多刺魚(yú)為0)，可以判斷依據(jù)系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果進(jìn)行群的劃分是可靠的，同種個(gè)體均聚在一支且遺傳距離小于0.02。八棘多刺魚(yú)和光身多刺魚(yú)的遺傳距離比較近(0.008<0.02)，且在系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果中，光身多刺魚(yú)也是嵌套在八棘多刺魚(yú)中，初步推測(cè)八棘多刺魚(yú)和光身多刺魚(yú)可能為同一物種。其他不同物種之間遺傳距離均大于0.02，初步推斷為不同物種(表2)。

3 討論

3.1 中華多刺魚(yú)物種的確定

在中國(guó)分布的刺魚(yú)類有以下4種，一種為分布于圖們江(鄭葆珊等，1980)和山東(成慶泰，周才武，1997)的三刺魚(yú)，另一種為刺魚(yú)(任慕蓮等，1981，即八棘多刺魚(yú))，還有一種是多刺魚(yú)(尼科爾斯基，1960)。尼科爾斯基在《黑龍江流域魚(yú)類》提到除了三刺魚(yú)外，同時(shí)也提到了其他多個(gè)地方志均對(duì)中華多刺魚(yú)有記載(王鴻媛，1984；劉嬋馨，秦克靜，1987；天津水產(chǎn)學(xué)會(huì)，1990；李明德，楊竹舫，1992；成慶泰，周才武，1997；王所安等，2000；李明德，2011)。這些文獻(xiàn)中記載的中華多刺魚(yú)重要形態(tài)鑒定特征基本一致，但對(duì)比記錄數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)形態(tài)長(zhǎng)度及長(zhǎng)度指標(biāo)比例存在較大偏差，同時(shí)本文獲得的數(shù)據(jù)也和已有報(bào)道有一定出入，可能是采集地不同及測(cè)量誤差造成的，如本文中頭長(zhǎng)為尾柄長(zhǎng)的1.2～2.0倍，為尾柄高的7.0～12.0倍，而《圖們江魚(yú)類志》(鄭葆珊等，1980)記載的中華多刺魚(yú)相應(yīng)指標(biāo)為4.6～4.8倍和1.7～1.9倍。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育研究，本研究樣本單獨(dú)聚為一支，群內(nèi)遺傳距離為0，與其他已知的多刺魚(yú)屬魚(yú)類的遺傳距離均超過(guò)了同種的遺傳距離，可以判定為中華多刺魚(yú)。

圖1 基于線粒體COⅠ基因的多刺魚(yú)屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig.1 Phylogenetic relationship of the genus Pungitius inferred from mitochondrial COⅠ gene

物種名稱NCBI登錄號(hào)或樣品編號(hào)數(shù)據(jù)來(lái)源內(nèi)群中華多刺魚(yú)PungitiussinensisHTU402427～HTU402431、HTU402436～HTU402440本研究沼澤多刺魚(yú)P.hellenicusKJ554130、KJ554255、KJ554514Geigeretal.,2014平腹多刺魚(yú)P.platygasterKJ554195、KJ554199、KJ554378Geigeretal.,2014光身多刺魚(yú)P.laevisKJ554327、KJ554413Geigeretal.,2014圖們江多刺魚(yú)P.tymensisKM019403Geigeretal.,2014八棘多刺魚(yú)P.pungitiusEU524319～EU524321、EU525105～EU525112Hubertetal.,2008八棘多刺魚(yú)P.pungitiusKJ128593、KJ128594Bergstenetal.,unpublished八棘多刺魚(yú)P.pungitiusKT630717、KT630718Rodgers&Mock,unpublished八棘多刺魚(yú)P.pungitiusKR477087～KR477089、KR477243～KR477245Thalingeretal.,2016八棘多刺魚(yú)P.pungitiusHQ712742Mecklenburgetal.,2011八棘多刺魚(yú)P.pungitiusKC015860、KC015861McCuskeretal.,2013八棘多刺魚(yú)P.pungitiusKM287043～KM287048Knebelsbergeretal.,2015八棘多刺魚(yú)P.pungitiusKR862862Denysetal.,2015外群Gasterosteussp.KJ553578、KJ553600、KJ553622、KJ553623Geigeretal.,2014二棘刺魚(yú)G.wheatlandiEU524640～EU524642Hubertetal.,2008三刺魚(yú)G.aculeatusKP823178、KP823179Rezansoffetal.,2015三刺魚(yú)G.aculeatusKR862765～KR862768Denysetal.,2015裸尾刺魚(yú)G.gymnurusKR862829～KR862832Denysetal.,2015冰島刺魚(yú)G.islandicusKR862833～KR862836Denysetal.,2015

表2 不同群(物種)之間遺傳距離計(jì)算結(jié)果Table 2 The genetic distance between different groups (species) of genus Pungitius

3.2 中華多刺魚(yú)的分布范圍及生境情況

卞紹雷等(2008)認(rèn)為北京是中華多刺魚(yú)分布的最南邊界，此次在河南林州的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步擴(kuò)大了該魚(yú)的分布范圍?！吨袊?guó)魚(yú)類系統(tǒng)檢索》(成慶泰，鄭葆珊，1987)提到中華多刺魚(yú)在長(zhǎng)江流域也有分布，但《長(zhǎng)江魚(yú)類》(湖北省水生生物研究所魚(yú)類研究室，1976)并沒(méi)有該魚(yú)的記載，因此該魚(yú)在長(zhǎng)江流域的分布情況需進(jìn)一步確認(rèn)。本文采集點(diǎn)屬淇河(衛(wèi)河水系)，該樣點(diǎn)水質(zhì)狀況良好，水體清澈，流水處有細(xì)沙質(zhì)地質(zhì)，而靜水處有20 cm厚淤泥，水體中有大量水草分布，該魚(yú)在水草較豐富靠近岸邊水流較緩處采集較多，這與其有筑巢行為有關(guān)。

3.3 林州市中華多刺魚(yú)的來(lái)源及保護(hù)

在對(duì)河南省魚(yú)類資源調(diào)查中，僅在林州一個(gè)采樣點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了中華多刺魚(yú)，且種群數(shù)量有限，這和該處生境水質(zhì)良好、有大量水草，適宜有特殊產(chǎn)卵習(xí)性的中華多刺魚(yú)繁殖有關(guān)。同時(shí)作者也訪問(wèn)了附近居民及林州市漁政管理人員，他們均反映之前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)此種魚(yú)類，也沒(méi)有該種魚(yú)的引入記錄，這也許與該種魚(yú)個(gè)體較小，沒(méi)有太大經(jīng)濟(jì)價(jià)值有關(guān)，因此推測(cè)可能為自然分布。此后調(diào)查隊(duì)數(shù)次在此地開(kāi)展復(fù)查，均獲得了數(shù)量不等的樣本，說(shuō)明中華多刺魚(yú)在該地仍保持一定數(shù)量。關(guān)于該種魚(yú)在林州的分布范圍，在調(diào)查隊(duì)擴(kuò)大采集范圍及安陽(yáng)市水產(chǎn)科學(xué)研究所開(kāi)展全市其他區(qū)縣調(diào)查中，均沒(méi)有采集到此種魚(yú)類，因此不排除人為帶入的可能性。但該種魚(yú)類在該樣點(diǎn)已經(jīng)形成相對(duì)穩(wěn)定的種群，且多次采樣均獲得該魚(yú)，說(shuō)明其可以適應(yīng)該處的水文條件。同時(shí)調(diào)查隊(duì)在該樣點(diǎn)采集獲得了包括中華多刺魚(yú)在內(nèi)的17種魚(yú)類，該樣點(diǎn)魚(yú)類種類多樣性較高。中華多刺魚(yú)為北京市二級(jí)保護(hù)動(dòng)物(http：//www.bjny.gov.cn/nyj/231595/232732/605601/490633/index.html)，同時(shí)，特殊的體型及繁殖習(xí)性讓該魚(yú)成為研究魚(yú)類進(jìn)化生物學(xué)、繁殖生物學(xué)、行為生態(tài)學(xué)的優(yōu)良模型。

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