嚴(yán)慧娟， 王巍， 易軍， 牛李麗， 屈羽， 陳昂， 蒲陽， 鄧家波， 鐘燕， 余建秋*

(1.成都動物園，成都野生動物研究所，成都610081；2. 四川省畜牧科學(xué)研究院，動物遺傳育種四川省重點實驗室，成都610066)

豚鹿Axisporcinus隸屬于哺乳綱Mammalia偶蹄目Artiodactyla鹿科Cervidae斑鹿屬Axis，中國僅有印支亞種A.porcinusannamiticus，主要分布于云南西部靠近中緬邊境的耿馬、西盟兩縣的南丁河沿岸，1975年被《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約(CITES)》列入附錄Ⅰ。近20年來，全球野生豚鹿數(shù)量急劇減少，世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)在2008年將其收錄到受威脅物種紅色名錄并列為瀕危(EN)等級。在中國，豚鹿被列為國家Ⅰ級重點保護(hù)野生動物，是我國數(shù)量最稀少的鹿類之一。目前，我國豚鹿野生種群基本滅絕(汪松，1998)，還保存有國家動物園系統(tǒng)的人工飼養(yǎng)群體，數(shù)量僅40只左右，已成為瀕危小種群。豚鹿的保種及擴繁一直受基礎(chǔ)群體數(shù)量有限、繁殖活動規(guī)律性不強和近親交配等因素制約。通過調(diào)查成都動物園豚鹿群體繁殖成活率，發(fā)現(xiàn)豚鹿的初生死亡率高達(dá)60%，主要因為其繁殖行為規(guī)律不明確，無法進(jìn)行相應(yīng)的機體調(diào)節(jié)和環(huán)境控制措施，導(dǎo)致初生幼崽發(fā)生環(huán)境應(yīng)激性死亡(鄧家波等，2011)。因此，明確各季節(jié)豚鹿體內(nèi)繁殖相關(guān)激素變化模式，確定其繁殖行為規(guī)律，對于提高繁殖成活率至關(guān)重要。

動物的繁殖行為涉及下丘腦-垂體-性腺軸系統(tǒng)復(fù)雜的神經(jīng)內(nèi)分泌過程(何世山，金小軍，2003)。光周期循環(huán)和溫度等一系列季節(jié)性節(jié)律變化因素能夠轉(zhuǎn)換為生理信號，刺激kisspeptin神經(jīng)元(Silveiraetal.，2010)，作用于下丘腦的GnRH神經(jīng)元，改變GnRH和促性腺激素的分泌模式，調(diào)節(jié)生殖行為(Malpauxetal.，2002；Smithetal.，2008)。對反芻動物的研究發(fā)現(xiàn)，直接參與繁殖的激素主要包括促黃體素(LH)、外周血液促卵泡素(FSH)和催乳素(PRL)，間接參與繁殖行為的激素為三碘甲腺原氨酸(T3)、四碘甲腺原氨酸(T4)(賴平等，2012；狄冉等，2015)。本研究通過監(jiān)測2015年5月、8月和10月雌性豚鹿血液中繁殖相關(guān)激素含量的變化，結(jié)合溫度、濕度和光照的變化，粗略繪制春季、夏季和秋季豚鹿季節(jié)性內(nèi)分泌調(diào)節(jié)趨勢圖。揭示圈養(yǎng)條件下季節(jié)變化與豚鹿繁殖的關(guān)系，明確豚鹿繁殖活動規(guī)律，以便根據(jù)季節(jié)調(diào)整養(yǎng)殖模式，有效提高豚鹿繁殖成活率，逐步擴繁種群。

1 材料與方法

1.1 試驗群體組建

在成都動物園的豚鹿群體中選擇16月齡左右的8頭雌鹿作為實驗動物，固定實驗群體。

1.2 溫濕指數(shù)及光照時間測定

在鹿舍中部距地面1.5 m處掛置干濕球溫度計，于2015年5—12月，記錄每日09∶00、12∶00、20∶00的溫度和濕度。按照Sandy(2000)提出的溫濕度指數(shù)(temperature-humidity index，THI)：THI=0.8×溫度+相對濕度×(溫度-14.4)+46.4計算；根據(jù)國際上THI值劃分熱應(yīng)激標(biāo)準(zhǔn)：THI<72，無熱應(yīng)激；THI=72～79，溫和應(yīng)激；THI=80～89，中等應(yīng)激；THI=90～98，嚴(yán)重應(yīng)激；THI>98，致死應(yīng)激。同時記錄每天晝長時間。

1.3 血液樣本采集和生化指標(biāo)測定

實驗期間，當(dāng)連續(xù)3 d的THI值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)時，于12∶00—14∶00采集8頭豚鹿的外周靜脈血，3 000 r·min-1離心10 min將血清和紅細(xì)胞迅速分離，分裝，于-20 ℃凍存。用T3、T4、LH、FSH和PRL的R & D上?？?zhǔn)鍱LISA試劑盒檢測。

取微孔平板，加入樣本10 μL，添加稀釋液40 μL，再加入HRP標(biāo)記抗體100 μL，于37 ℃封閉水浴60 min。反復(fù)洗滌5次，加入底物各50 μL于37 ℃避光孵育15 min，加入50 μL終止液，于15 min內(nèi)在450 nm波長處測定光密度值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行K-S檢驗，顯著性水平為α=0.05。利用R語言對差異性狀及群體進(jìn)行層次聚類分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 豚鹿圈舍THI值和光照趨勢

8月豚鹿圈舍內(nèi)THI值為72～80，為溫和應(yīng)激。其余月份的THI值均在72以下，無熱應(yīng)激。晝長時間變化趨勢分析發(fā)現(xiàn)，6—8月的光照時間較長，日均達(dá)到13.63 h以上。10—12月的光照時間較短，日均為10.66 h(圖1)。

2.2 豚鹿激素水平季節(jié)性變化趨勢

分析發(fā)現(xiàn)，8月豚鹿血清中T3、T4的含量極顯著低于5月、10月(P<0.01)。LH、PRL的含量在8月均極顯著下降(P<0.01)，在10月極顯著回升(P<0.01)。FSH在8月的含量極顯著低于5月(P<0.01)，但與10月的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

2.3 各激素指標(biāo)間相關(guān)性分析

血清中LH、FSH、PRL、T3、T4含量相關(guān)性分析顯示(表1)，F(xiàn)SH與T3呈極顯著正相關(guān)(P<0.01，r=0.647)，PRL與T4呈顯著正相關(guān)(0.01

圖1 豚鹿圈舍溫濕度指數(shù)和晝長時間
Fig. 1 The trend of temperature-humidity index in breeding houses ofAxisporcinusand daylength

圖2 豚鹿血清中激素含量變化趨勢Fig. 2 The variation of hormone content in serum of Axis porcinus

**P<0.01，*P<0.05； 下同the same below

表1 豚鹿血清中激素含量相關(guān)性分析(n=24)Table 1 Correlation analysis of hormone content in serum of Axis porcinus (n=24)

2.4 各激素指標(biāo)間層次聚類分析

將5月、8月和10月各樣本中LH、FSH、PRL、T3、T4活性情況進(jìn)行層次聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T3、T4聚為一類，LH、PRL聚為一類，并且與FSH為二級聚類(圖3)。表明T3、T4活性的變化模式相似度較高，LH、PRL活性的變化模式相似度較高，但FSH的活性變化模式與其余4種激素有差異。

圖3 豚鹿血清各激素聚類圖Fig. 3 Cluster of hormones in serum of Axis porcinus

3 討論

T3、T4在血清中的含量變化與熱應(yīng)激的時間和應(yīng)激程度存在密切聯(lián)系(Yokusetal.，2006)。研究發(fā)現(xiàn)，T3、T4在各樣本中的變化模式相同；8月圈舍THI值達(dá)72～80、日照時間達(dá)13.63 h以上時，豚鹿血清中T3、T4的含量極顯著低于5月、10月，與同為反芻動物的奶牛在濕熱脅迫下的表現(xiàn)一致(Collieretal.，1981；魏學(xué)良等，2005；樊華等，2007)。對馬鹿Cervuselaphus的研究亦發(fā)現(xiàn)，T3、T4的分泌存在季節(jié)性變化(施振旦，1995)。推測較高的溫濕度和長日照所形成的脅迫造成了機體應(yīng)激，使血漿中的T3、T4含量均顯著降低，從而調(diào)節(jié)自身體溫。大量研究表明，T3、T4含量的改變并不引起褐黑激素的變化，而通過影響下丘腦(Websteretal.，1991)，調(diào)節(jié)kisspeptin神經(jīng)系統(tǒng)和GnIH神經(jīng)系統(tǒng)對動物的季節(jié)性繁殖起調(diào)節(jié)作用(Bernal，2002；Yasuoetal.，2006)。本研究通過激素間的相關(guān)性分析，證明了T3、T4的活性與繁殖相關(guān)激素具有相關(guān)關(guān)系。因此，推測高溫、高濕和長日照的脅迫可能引起血清中T3、T4含量的變化，間接影響豚鹿的繁殖表現(xiàn)。

LH是由垂體前葉促黃體素細(xì)胞嗜堿性細(xì)胞產(chǎn)生的一種糖蛋白激素，能夠作用于成熟的卵泡并促發(fā)排卵(Wuetal.，2000)。研究發(fā)現(xiàn)，在繁殖期不同階段，丘腦GnRH分泌的脈沖頻率不同。繁殖期開始時，LH在排卵期前達(dá)到最大值，在繁殖末期降至最低，隨后卵巢進(jìn)入靜止期(Clarke，1993；王訓(xùn)立等，2002)。FSH是由垂體前葉嗜堿性細(xì)胞分泌的一種糖蛋白激素，能夠在繁殖期促使卵泡內(nèi)膜細(xì)胞分泌雌激素，激發(fā)卵泡的最后成熟，誘發(fā)排卵并使顆粒細(xì)胞變成黃體細(xì)胞(解美娜等，2004)。對灘羊Procapraprzewalskii的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH和LH含量變化具有顯著的季節(jié)性，且秋冬高于春夏(祁云霞等，2014)。另有研究發(fā)現(xiàn)，隨春季光照延長，哺乳動物達(dá)到FSH分泌上升的光照閾值，隨后LH也隨著光照的進(jìn)一步延長而增加(楊海明，2014)。PRL作為一種由垂體前葉腺嗜酸細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)激素，可以促進(jìn)乳腺生長發(fā)育，刺激并維持泌乳(Bole-Feysotetal.，1998)。研究發(fā)現(xiàn)，隨光照和溫度的變化，馬崗鵝Bostaurus血漿中PRL的濃度呈周期性變化(黃運茂等，2007)。本研究發(fā)現(xiàn)，8月THI值較高時，豚鹿血清中的LH、PRL含量極顯著低于5月、10月，F(xiàn)SH含量極顯著低于5月，表明豚鹿繁殖相關(guān)激素的分泌與光照時長和THI值相關(guān)，季節(jié)變化能夠在一定程度上影響豚鹿的繁殖效率。豚鹿繁殖激素的變化模式符合短光照繁殖類型動物隨光照延長、繁殖激素表達(dá)降低的基本特征，推斷豚鹿屬于短光照繁殖類型動物。光照延長后，豚鹿GnRH活化的同時也激發(fā)雌激素的負(fù)反饋作用，使機體進(jìn)入非繁殖期(Knightetal.，1983；賀建寧等，2013)，另外，夏季的高溫高濕脅迫也是限制豚鹿繁殖表現(xiàn)的重要因素。

本研究發(fā)現(xiàn)，豚鹿屬于短光照繁殖類型動物，夏季的高溫、高濕和長光照會影響豚鹿繁殖相關(guān)激素的分泌。由于圈養(yǎng)環(huán)境外在遮擋物較少，豚鹿直接受到強光和高濕熱脅迫而產(chǎn)生應(yīng)激，建議在飼料中添加抗應(yīng)激類添加劑，或改善圈舍條件，如增加遮光設(shè)施、增加植被和噴淋設(shè)施降低溫度等，以便緩解應(yīng)激對機體生殖激素的逆向調(diào)節(jié)，在一定程度上提高其繁殖效率。

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