朱玲

牛病毒性腹瀉病，又稱牛黏膜病，是由牛病毒性腹瀉一黏膜病毒引起牛、羊、豬、鹿以及駝科動物等多種動物感染的一種重要傳染病，嚴(yán)重危害我國養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。該病主要表現(xiàn)為被感染動物腹瀉、脫水、電解質(zhì)失衡、持續(xù)感染與免疫耐受及母畜流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和畸形胎等特征。牛病毒性腹瀉一黏膜病呈世界分布，尤其是歐美等畜牧業(yè)發(fā)達(dá)國家地區(qū)，血清抗體陽性率很高。每年世界各地死于該病感染的牛不少于500萬頭，由于持續(xù)感染等造成的間接損失達(dá)到數(shù)百億美元。目前，在我國養(yǎng)牛業(yè)集中的省份冬春季發(fā)病率較高，已有20多個省份報道有該病，我國將其規(guī)定為三類動物疫病。

目前，有多種血清學(xué)方法用于牛病毒性腹瀉病的診斷，國內(nèi)外多用完整的病毒粒子為抗原檢測BVDV抗體水平。為初步掌握青海省海北州牛病毒性腹瀉一黏膜病毒病的感染水平和流行規(guī)律，本實驗我們應(yīng)用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），對該地區(qū)5個規(guī)?；B(yǎng)殖場及部分散養(yǎng)牛只感染狀況進(jìn)行了血清學(xué)篩查，以期對該病在本地區(qū)的流行情況提供參考，為該病的凈化和綜合防控提供依據(jù)，對畜產(chǎn)品健康發(fā)展和人類健康都具有重要意義。

1材料與方法

1.1血清樣品

采集青海省海北州5個規(guī)?；?月齡以上牛血清共計140份，散養(yǎng)戶血清16份。全部采用頸靜脈抽取適量的血液，做好標(biāo)記。將采集的血液擺成斜面，于37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置1～2h，置于4℃冰箱中24h后分離血清，保存待檢。

1.2主要試劑

牛病毒性腹瀉病毒抗體檢測試劑盒購自北京愛德士元亨愛生物科技有限公司（IDEXX），陰性、陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清及稀釋液等均來自試劑盒內(nèi)，在有效期內(nèi)使用。96孔平底酶標(biāo)板，移液器配套移液槍尖若干。

1.3間接酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測方法

間接ELISA具體檢測方法按照試劑盒說明進(jìn)行操作，具體步驟如下：

1）試劑的準(zhǔn)備。20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

2）洗板方法。甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板4次。

3）從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，設(shè)置陰性、陽性對照孔和樣本孔，每個樣品重復(fù)檢測2個孔，每孔加入各50uL。

4）將各孔待測樣血清病毒混合物按次序轉(zhuǎn)移至ELISA板上，每孔先加待測樣本10uL，再加樣本稀釋液40uL。

5）隨后陰、陽性對照孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗原100uL，用封板膜封板，37℃溫育1h。同上洗板5次，吸水紙上拍干。

6）每孔加入底物A、B各50uL，37℃避光溫育15min。

7）每孔加入終止液50uL終止反應(yīng)，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值，進(jìn)行結(jié)果判定。

1.4結(jié)果判定

血清中牛病毒性抗體按照試劑盒說明書進(jìn)行結(jié)果判定。計算待檢血清的S/P值，陰性對照孔OD平均值必須小于或等于0.15，陽性對照孔OD平均值必須大于或等于1.00時檢測結(jié)果才有效。先確定出臨界值為陰性對照孔平均值+0.15，以樣品校正OD/陽性對照OD大于0.3為陽性。

2結(jié)果與分析

由間接酶聯(lián)免疫吸附試驗測得結(jié)果顯示：待檢的156份血清，陽性數(shù)為57份，陽性率為11.1%～52.0%，5個規(guī)?；B(yǎng)殖場及散養(yǎng)牛血清均能檢測到陽性病例，但不同牛場該病的感染率差別很大，平均感染率為29.5%，最高的牛場陽性率可達(dá)52.0%。散養(yǎng)牛感染率較低。該結(jié)果表明青海省海北州地區(qū)牛群存在普遍的牛病毒性腹瀉病感染，應(yīng)及時采取措施予以控制和凈化。

3討論

牛病毒性腹瀉病是養(yǎng)牛場常見的多發(fā)傳染病，引起多種動物感染，分布廣泛，以發(fā)熱、腹瀉、脫水及懷孕母牛流產(chǎn)或產(chǎn)出畸形胎兒為主要特征，常呈持續(xù)性感染，嚴(yán)重危害患病牛群的免疫功能，給養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來牛病毒性腹瀉在我國發(fā)病報道日趨增多，流行情況嚴(yán)峻，很多部門加強了對牛病毒性腹瀉特點和流行病學(xué)調(diào)查的研究，加快了對牛病毒性腹瀉的監(jiān)測控制和凈化根除工作。而ELISA方法是具有特異性強，靈敏度高，重復(fù)性好的一種血清學(xué)方法，可以檢測出牛病毒性腹瀉病的抗體陽性率，反映該病的流行情況，確定感染率。便于及時對患病牛進(jìn)行隔離或淘汰，清除傳染源。

本實驗為了闡明牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）在青海省海北州地區(qū)牛群的感染狀況，筆者對其中五個規(guī)模化牛場以及散養(yǎng)牛群的血液樣品156份牛血清進(jìn)行BVDV血清抗體的檢測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)青海各地牛群存在普遍的BVDV感染，不同牛場該病檢測結(jié)果差別很大，感染率為11.1%～52.0%，主要見于規(guī)?；?，而散養(yǎng)牛感染以散發(fā)為主，感染率較低。出現(xiàn)該結(jié)果也可能與筆者抽檢樣品中散養(yǎng)牛數(shù)量有限，多數(shù)樣品來自規(guī)?；鲇嘘P(guān)，因此試驗結(jié)果具有一定的局限性。

隨著我國奶牛和肉牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，牛傳染病的流行狀況與以往相比較發(fā)生了巨大變化，出現(xiàn)了很多新發(fā)型疾病及傳人型疾病，給養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此養(yǎng)牛場應(yīng)加強平時的飼養(yǎng)管理，堅持自繁自養(yǎng)的方針。養(yǎng)殖場應(yīng)做好圈舍定期衛(wèi)生消毒工作，保證圈舍的清潔、干燥，對病牛污染的場所應(yīng)嚴(yán)格消毒，進(jìn)行無害化處理。根據(jù)牛病毒性腹瀉病的流行特點，堅持以預(yù)防為主，對牛病毒性腹瀉常發(fā)區(qū)定期用豬瘟弱毒苗對牛群進(jìn)行預(yù)防免疫。endprint