劉聰+吳加梁+趙娜+孫健+沈曉霞+王志安

[摘要] 應(yīng)用HPLC和紫外分光光度計(jì)測定了26份不同產(chǎn)地的枳椇子Hovenia acerba中二氫楊梅素和總黃酮的含量，并進(jìn)一步探討了枳椇子品質(zhì)指標(biāo)二氫楊梅素和總黃酮與產(chǎn)地、外觀性狀的相關(guān)性。結(jié)果表明，不同來源的枳椇子品質(zhì)差異較大，二氫楊梅素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.41～9.81 mg·g-1；總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.52～21.98 mg·g-1。聚類分析表明，枳椇子品質(zhì)與局部產(chǎn)區(qū)來源有相關(guān)性，鄂北皖南的江漢平原地區(qū)枳椇子質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定，區(qū)域內(nèi)枳椇子樣品質(zhì)量較優(yōu)。相關(guān)性分析表明，千粒重和紅黑籽粒的比例與二氫楊梅素的含量極顯著正相關(guān)；而總黃酮含量與千粒重以及紅黑籽粒比例無相關(guān)關(guān)系，千粒重和紅黑籽粒的比例可做為初步判定枳椇子品質(zhì)優(yōu)劣的指標(biāo)。另外，二氫楊梅素含量與總黃酮含量無相關(guān)關(guān)系，考察枳椇子品質(zhì)時(shí)應(yīng)兼顧兩者。

[關(guān)鍵詞] 枳椇子； HPLC； 品質(zhì)； 外觀； 產(chǎn)地

[Abstract] The contents of dihydromyricetin and total flavonoids of Hovenia acerba seeds were detected by HPLC-DAD and UV spectrophotometer. And then the correlation between the habitat， phenotype and quality of H. acerba seeds were deeply studied. There were big differences in both appearance and quality among the H. acerba seeds from different places. It showed that the content of dihydromyricetin in H. acerba seeds was 0.41-9.81 mg·g-1， and the content of total flavonoids was 5.52-21.98 mg·g-1. The cluster analysis showed that the quality of H. acerba seeds was related to the habitat. The samples from Jianghan Plain Area showed relatively stable and excellent quality. According to the correlation analysis， there was a significant positive correlation between 1 000-seeds weight， red-black seeds ratio and the content of dihydromyricetin， while the content of total flavonoids was not related to the 1 000-seeds weight and red-black seeds ratio. So the 1 000-seeds weight and red-black seeds ratio could be used as an initial judgment of the quality of H. acerba seeds. As dihydromyricetin and total flavonoids content was not related， both dihydromyricetin and total flavonoids should be taken into account when the quality of H. acerba seeds was studied.

[Key words] Hovenia acerba； HPLC； quality； phenotype； habitat

枳椇子主要為鼠李科枳椇屬Hovenia Thunnb.植物枳椇H. acerba Lindl.的成熟種子，部分地方炮規(guī)中規(guī)定北枳椇H. dulcis Thunb.也為枳椇子的植物基源。枳椇子是藥食兩用藥材，其肉質(zhì)膨大的花序軸成熟后口味甘甜可生食，亦可釀酒、醋；其種子富含油脂和蛋白質(zhì)，具有一定營養(yǎng)價(jià)值[1]。枳椇子性平、味甘，載于《唐本草》、《雷公炮炙論》和《本草綱目》等多部中醫(yī)藥著作中，常用于止渴除煩，清濕熱，解酒毒，利二便。現(xiàn)代藥理研究表明枳椇子具有解酒護(hù)肝，抗炎抗氧化，預(yù)防肝纖維化、脂肪肝等病癥的作用[2]。枳椇子含有黃酮、皂苷、生物堿、有機(jī)酸酯等活性成分[3]。Song等[4]研究表明二氫楊梅素為枳椇子的主要黃酮類化合物，而研究發(fā)現(xiàn)枳椇子中二氫楊梅素具有明確的解酒作用[5]，此外二氫楊梅素還具有減輕四氯化碳造成的急性肝損傷的作用[6]，這與古籍中記載枳椇子解酒保肝的功效相契合。因此，本研究選取二氫楊梅素和總黃酮2個(gè)指標(biāo)直接評(píng)價(jià)枳椇子的品質(zhì)。

目前，對(duì)于枳椇子的研究主要集中在藥理藥效領(lǐng)域，有關(guān)品質(zhì)和藥材基原的研究較少，各地區(qū)的炮制規(guī)范僅有外觀上的描述，認(rèn)為紅棕色為佳。綜合考慮枳椇子的產(chǎn)地、外觀和有效成分，本文以我國13個(gè)省份的26份枳椇子材料為研究對(duì)象，統(tǒng)計(jì)千粒重和種子顏色組成，測定總黃酮和二氫楊梅素，分析其品質(zhì)與產(chǎn)地的相關(guān)性，為枳椇子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

1.1 樣品與試劑

成熟新鮮帶有種子、肉質(zhì)花序軸的枳椇果枝于2016年10—11月采自浙江、湖北、湖南、陜西等13個(gè)省份的26個(gè)地區(qū)（表1），經(jīng)浙江省中藥研究所沈曉霞教授鑒定均為枳椇H.acerba。剝離得到種子，即為枳椇子，置于50 ℃烘12 h至恒重，密封儲(chǔ)藏于4 ℃，待用。endprint

主要試劑為二氫楊梅素（批號(hào)BCBC8837，純度≥98%，Sigma）、蘆?。ㄅ?hào)K1618018，純度≥97%，Aladdin）；乙腈色譜純（TEDIA）；其他無機(jī)物藥品購自國藥集團(tuán)。

1.2 儀器設(shè)備

Agilent高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent，1100 series）、色譜柱（Dikma，C18）、紫外分光光度計(jì)（Agilent，Cary-60）、恒溫水浴鍋（晶玻實(shí)驗(yàn)儀器公司，HH-6）、離心機(jī)（Thermo，Sorvall ST-16）、分析天平（Mettler-Toledo，ML-204）、粉碎機(jī)（IKA，A-11）等。

2 方法

2.1 枳椇子質(zhì)量評(píng)價(jià)

從外觀和有效成分含量2個(gè)方面考察枳椇子的品質(zhì)，分別統(tǒng)計(jì)千粒重、枳椇子顏色組成，測定總黃酮含量和二氫楊梅素含量，數(shù)據(jù)重復(fù)3次。

2.2 千粒重的測定

每份材料隨機(jī)取枳椇子種子20 g，統(tǒng)計(jì)種子數(shù)量，進(jìn)而計(jì)算枳椇子千粒重。

2.3 枳椇子顏色統(tǒng)計(jì)

枳椇子種子一般有紅色和暗黑色2種，且2種顏色種子可以著生在同一果枝上。每份材料隨機(jī)取枳椇子種子100粒，統(tǒng)計(jì)不同顏色枳椇子的數(shù)量，進(jìn)而計(jì)算紅色籽粒和黑色籽粒子的比例。

2.4 供試樣品制備

2.4.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取二氫楊梅素對(duì)照品10.00 mg，置于10 mL量瓶中，70%乙醇定容，制得將二氫楊梅素質(zhì)量濃度為1.00 g·L-1溶液作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 1.00 mL，用70%乙醇稀釋至10 mL作標(biāo)準(zhǔn)液，其質(zhì)量濃度為1.0 g·L-1。檢測前配置成質(zhì)量濃度分別為

20.0，40.0，60.0，80.0，100.0 mg·L-1的梯度對(duì)照品溶液。

精密稱取經(jīng)干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品10.00 mg，置于50 mL量瓶中，70%乙醇定容，將蘆丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.20 g·L-1溶液作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。檢測前加入70%乙醇梯度配置成質(zhì)量濃度分別為10.0，20.0，60.0，80.0，100.0 mg·L-1的對(duì)照品溶液。

2.4.2 供試品溶液制備 樣品打粉，過藥典3號(hào)篩。精密稱取枳椇子粉末1 000.0 mg，置于平底燒瓶中。精密加入70%乙醇40.0 mL，密塞，稱重。加熱回流提取2 h，放冷，再稱重，以70%乙醇補(bǔ)足失重，超聲混勻，取上清液，過濾待用。

2.5 總黃酮的測定

參考易躍能等[7]測定總黃酮的方法，在此方法的基礎(chǔ)上，稍加改進(jìn)。樣品制備參考2.4.2項(xiàng)，取1.0 mL提取液，置于10 mL量瓶中，加5% NaNO2 1.0 mL，搖勻，放置6 min；再加10% Al（NO3）3 1.0 mL，搖勻，放置6 min；加4% NaOH 5.0 mL，搖勻，放置15 min；以4 500 r·min-1離心6 min，取上清液，在510 nm波長處測定。標(biāo)準(zhǔn)曲線用蘆丁對(duì)照品繪制。

2.6 二氫楊梅素的測定

測試樣品制備參考2.4.2項(xiàng)，色譜柱Dikma C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量10.0 μL；柱溫35 ℃；檢測波長 290 nm；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫程序?yàn)?～10 min，15%～12% A；10～15 min，12%～16% A；15～16 min，16%～90% A；16～18 min，90% A；18～19 min，90%～15% A；19～30 min，15% A。在上述色譜條件下，供試品及對(duì)照品溶液的HPLC圖譜見圖1。

2.7 水分測定

水分含量測定參照 GB/T14489.1-1993，105 ℃恒重法。

2.8 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用IBM SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用類間平均鏈鎖法和選擇歐氏距離系數(shù)對(duì)26份枳椇子產(chǎn)地的地理分布狀況和品質(zhì)組成進(jìn)行聚類分析。選擇Pearson法對(duì)枳椇子不同品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。

3 結(jié)果

3.1 枳椇子地理產(chǎn)地聚類分析

26份枳椇子材料產(chǎn)地包含了我國枳椇子的主要產(chǎn)區(qū)，根據(jù)枳椇采集地經(jīng)緯度聚類分析可知26份枳椇種質(zhì)分別來自：A東南山區(qū)；B橫斷山脈地區(qū)；C秦嶺山脈地區(qū)；D江漢平原地區(qū)；E雪峰山脈地區(qū)；F西南和嶺南地區(qū)六大區(qū)域，見圖2。

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 線性關(guān)系考察 精密量取2.4.1項(xiàng)下二氫楊梅素對(duì)照品溶液，以2.6項(xiàng)下方法，分別進(jìn)樣，以峰面積（Y），對(duì)照品濃度（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得二氫楊梅素的線性回歸方程為Y=23.256X+4.16，R2=0.999 7，線性范圍 20.0～100 mg·L-1，表明在此范圍內(nèi)數(shù)據(jù)線性關(guān)系良好。

精密量取2.4.1項(xiàng)下蘆丁對(duì)照品溶液，以2.5項(xiàng)下方法測定，以吸光度（Y），對(duì)照品濃度（X），得線性回歸方程為：Y=0.013 9X-0.003 8，R2=0.999 8，線性范圍為10.0～100.0 mg·L-1，表明在此范圍內(nèi)數(shù)據(jù)線性關(guān)系良好。

3.2.2 精密度試驗(yàn) 分別取20.0，40.0，60.0，80.0，100.0 mg·L-1二氫楊梅素對(duì)照品，以2.6項(xiàng)下方法，重復(fù)進(jìn)樣3次，記錄二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)液的峰面積，計(jì)算RSD在0.04～0.38%，表明儀器精密度良好。

分別取10.0，20.0，60.0，80.0，100.0 mg·L-1蘆丁對(duì)照品，以2.5項(xiàng)下方法，分別重復(fù)測定3次，RSD為0.23%～0.78%，表明儀器精密度良好。

3.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品溶液6份，以2.6項(xiàng)下方法測定，并記錄樣品中二氫楊梅素的峰面積，計(jì)算RSD 0.39%，表明該方法重復(fù)性好。endprint

取同一供試品溶液，以2.5項(xiàng)下方法，平行測定6份溶液，并記錄樣品中總黃酮的吸光度，RSD 1.0%，表明該方法重復(fù)性好。

3.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液1.0 mL，以2.6項(xiàng)下方法，分別在0，2.5，5，7.5，10，12.5，15 h下測定，并記錄樣品中二氫楊梅素的峰面積，計(jì)算RSD為0.59%，表明供試品溶液在常溫下15 h內(nèi)穩(wěn)定。

取同一供試品溶液，以2.5項(xiàng)下方法，分別在0，10，15，20，30 min測定樣品吸光度，RSD為0.67%，表明該方法測定值在常溫下加入顯示劑后30 min內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.5 加樣回收率 取同一供試品溶液，按原有量的80%，100%，120%加入二氫楊梅素對(duì)照品溶液，以2.6項(xiàng)下方法測定，記錄二氫楊梅素峰面積，計(jì)算平均回收率為95.78%，RSD 0.010%，表明該方法符合含量測定的基本要求。

取同一供試品溶液，按原有量的80%，100%，120%加入蘆丁對(duì)照品，以2.5項(xiàng)下方法，測定6份溶液，平均回收率為100.1%，RSD為0.59%，表明該方法符合含量測定的基本要求。

3.3 枳椇子品質(zhì)

不同地區(qū)來源的枳椇子的大小、顏色外觀、總黃酮含量和二氫楊梅素含量差異較大，見表1。枳椇子千粒重一般大于15 g，主要分布于15～25 g，見圖3A。四川雅安和四川攀枝花2份枳椇子全部呈現(xiàn)土黃色，不同于其他地區(qū)的枳椇子，紅色籽粒和黑色籽粒比值一般小于5，少數(shù)種質(zhì)如河南信陽和浙江衢州的枳椇黑色籽粒較少，見圖3B。枳椇子總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)集中于12～18 mg·g-1的蘆丁當(dāng)量，26份枳椇的總黃酮含量接近二項(xiàng)分布，見圖3C，該結(jié)果與姚小華等研究結(jié)果一致[8]。大部分枳椇子二氫楊梅素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于4.0 mg·g-1，信陽的枳椇二氫楊梅素含量表現(xiàn)突出，質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)9.81 mg·g-1，見圖3D。

相關(guān)性分析可知二氫楊梅素含量與千粒重和紅黑粒比例2項(xiàng)指標(biāo)極顯著正相關(guān)（P<0.01），Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.733，0.560。而二氫楊梅素含量、千粒重和紅黑粒比例均與總黃酮不相關(guān)，見表2。攀枝花和雅安2份枳椇子的顏色全部為土黃色，該表型與其他材料明顯不同，可能是川南枳椇居群的遺傳調(diào)控決定，這2組材料不參與紅黑粒比例與枳椇子品質(zhì)的相關(guān)關(guān)系分析。

以總黃酮和二氫楊梅素為品質(zhì)參考指標(biāo)，26份枳椇子可聚成4大類，結(jié)果見圖4。陜西省枳椇主要聚在Ⅰ類，該組總黃酮含量較高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于16.00 mg·g-1，但二氫楊梅素的含量比較低，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均小于4.00 mg·g-1；浙江枳椇主要聚在Ⅲ 類，該組總黃酮含量較低，但二氫楊梅素的含量比較高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2～6 mg·g-1；江漢平原的襄陽和信陽2份枳椇子單獨(dú)聚為一組，該組枳椇的各項(xiàng)品質(zhì)

指標(biāo)均較優(yōu)；四川攀枝花的枳椇材料黃酮含量很低，籽粒也偏小，呈土黃色，與其他地域來源的枳椇顯著不同，單獨(dú)聚為Ⅳ類。

結(jié)合品質(zhì)值聚類結(jié)果，在收集材料的地理劃分基礎(chǔ)上將品質(zhì)指標(biāo)較特殊的攀枝花數(shù)據(jù)剔除，湖北宜昌地區(qū)數(shù)據(jù)歸到西南山區(qū)的E組，獲得不同地理產(chǎn)區(qū)枳椇子品質(zhì)變異分析見表3。

4 討論

4.1 枳椇子品質(zhì)與產(chǎn)地

本研究中枳椇子采集時(shí)間和前處理?xiàng)l件一致，采集樣本為的某一地區(qū)的枳椇子混合樣品，反映了 某一地區(qū)藥材生物居群的整體狀況，因此造成不同地域枳椇子品質(zhì)差異的原因主要為基因型差異和生長環(huán)境差異。

對(duì)比圖2，4可以看出，同一產(chǎn)區(qū)的枳椇子樣本按品質(zhì)指標(biāo)數(shù)據(jù)聚類基本可以聚在一起，該結(jié)果說明枳椇子的產(chǎn)區(qū)分布和品質(zhì)特征具有相關(guān)性，即雖然枳椇子產(chǎn)區(qū)分布較廣，但是存在品質(zhì)較優(yōu)的枳椇子產(chǎn)區(qū)。

由表3數(shù)據(jù)可知，不同產(chǎn)區(qū)的枳椇子品質(zhì)總體差異較大，以浙江和福建為代表的東部產(chǎn)區(qū)（A組）、陜南主產(chǎn)區(qū)（C組）和漢中主產(chǎn)區(qū)（D組）的枳椇子二氫楊梅素含量較西南地區(qū)（E組和F組）高出約50%；同時(shí)，東部產(chǎn)區(qū)枳椇子的總黃酮含量明顯低于其他產(chǎn)區(qū)。部分產(chǎn)區(qū)內(nèi)部樣本品質(zhì)差異性較大，如東部產(chǎn)區(qū)；局部產(chǎn)地的枳椇子品質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，如陜南產(chǎn)區(qū)和江漢平原產(chǎn)區(qū)。然而限于統(tǒng)計(jì)樣本較小，產(chǎn)區(qū)劃分較大，該組數(shù)據(jù)僅初步反映了不同產(chǎn)區(qū)的枳椇子的品質(zhì)指標(biāo)的差異性和穩(wěn)定性。依據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大江漢平原產(chǎn)區(qū)的樣本量，進(jìn)而明確我國品質(zhì)優(yōu)異，且功效成分含量穩(wěn)定性較好的枳椇子產(chǎn)區(qū)。

4.2 枳椇子有效成分與表觀特性

中藥材品質(zhì)控制和分析一直以來是中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)和難點(diǎn)，目前中藥材的品質(zhì)評(píng)價(jià)以有效成分的測定為主[9]。然而外觀品質(zhì)鑒別具有檢測成本低，操作快捷的特點(diǎn)，是中藥材品質(zhì)優(yōu)劣、真?zhèn)伪鎰e的經(jīng)典方法[10]，也是現(xiàn)代中藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要組成部分。本文證明千粒重大，紅黑籽粒比例大的枳椇子與功效成分——二氫楊梅素的含量顯著正相關(guān)，說明這2個(gè)表觀性狀可以作為枳椇子品質(zhì)初步判定的參考指標(biāo)。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]endprint