張亞青+李莎+汪洋+孫夢影+黃園園+趙仁邦

摘要：以生酸棗仁為原料，以總黃酮的提取量為指標確定生酸棗仁中總黃酮的提取條件，并建立了一種同時測定生酸棗仁中斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素含量的高效液相色譜（HPLC）分析方法。利用單因素試驗和響應面試驗進行優(yōu)化，最終確定超聲提取法提取總黃酮的最佳條件為：料液比為1 g ∶50 mL，超聲時間為60 min，超聲功率為 270 W，乙醇濃度為50%。在此條件下，生酸棗仁中總黃酮的提取量為6.37 mg/g。測定的色譜條件為：COSMOSIL C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；梯度洗脫，流速為0.80 mL/min；柱溫為25 ℃，檢測波長為335 nm。斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素在50～500 μg/mL范圍內具有良好的線性關系（r2=0.999，r2=0.999），平均加標回收率為9996%和100.11%，最低檢出限為2.07 μg/mL和1.54 μg/mL。該方法靈敏度高，專屬性強，可用于生酸棗仁中斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素的測定。

關鍵詞：生酸棗仁；總黃酮；提??；HPLC；斯皮諾素；6-阿魏酰斯皮諾素

中圖分類號：R284 文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）23-0198-05

酸棗仁總黃酮是酸棗仁的重要成分，現(xiàn)代藥理研究表明，它對動物有著鎮(zhèn)靜催眠的作用，是酸棗仁中起鎮(zhèn)靜催眠作用的活性物質之一[7]。而Li等的試驗結果表明酸棗仁黃酮（主要是斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素）是酸棗仁中發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠的活性物質之一[8]。鮑康德等曾采用高效液相色譜和蒸發(fā)光散射檢測器聯(lián)用法（HPLC-ELSD）同時測定中藥酸棗仁中6種主要黃酮及皂苷類成分的含量[9]。閆艷等采用HPLC-DAD-ELSD法同時測定酸棗仁中斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和B的含量[10]；劉昌輝等采用LC-MS/MS法測定酸棗仁中酸棗仁皂苷A、B和斯皮諾素的含量[11]。曾有人采用高效液相色譜法（HPLC）測定酸棗仁顆粒[12]、酸棗仁湯[13]以及理棗仁[14]中的斯皮諾素含量，但是近年研究報道中未出現(xiàn)采用HPLC法同時測定生酸棗仁中的斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素，所以筆者采用響應面法優(yōu)化生酸棗仁中總黃酮提取條件，并首次采用HPLC法對生酸棗仁總黃酮中的主要成分斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素進行含量測定，建立快速、靈敏、同時測定生酸棗仁中斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素的方法，以期為酸棗仁質量控制提供簡便快速的方法，為臨床使用生酸棗仁提供合理依據(jù)。

1儀器與試劑

1.1儀器

KQ 5200 DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHD-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（保定高新區(qū)陽光科教儀器廠）；RE-52A旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；CP114電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]；TD4-5K臺式低速離心機（湖南長沙易達儀器有限公司）；UV-5200PC紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；Waters 2998高效液相色譜儀（低壓梯度泵，PDA檢測器）（美國Waters 公司）；COSMOSIL C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（日本NACALAI公司）

1.2試劑

生酸棗仁，購于河北省保定市安國藥材市場；無水乙醇（分析純），天津市天力化學試劑有限公司；石油醚（60～90 ℃，分析純），天津市富起化工有限公司；亞硝酸鈉（分析純），北京亞太龍興化工有限公司；硝酸鋁（分析純），天津市天力化學試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純），天津市天力化學試劑有限公司；蕓香苷標準品，上海源葉生物科技有限公司；斯皮諾素標準品（純度≥99%），上海源葉生物科技有限公司；6-阿魏酰斯皮諾素標準品（純度≥99%），上海源葉生物科技有限公司；乙腈（色譜純），賽默飛世爾科技（中國）有限公司；娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司。

2試驗方法

2.1原料預處理

將潔凈的生酸棗仁用高速萬能粉碎機粉碎，40目過篩，備用。

將干燥的生酸棗仁粉末置于索氏提取器中，用20倍量的石油醚（60～90 ℃）水浴回流提取3次，每次5 h，回收石油醚。將脫脂后的酸棗仁粉末揮盡殘留的石油醚至無醚味，混勻后于干燥器中密封備用。

2.2方法

2.2.1酸棗仁總黃酮含量測定采用紫外分光光度計法，以蕓香苷作為標準品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法[15]測定生酸棗仁中的總黃酮含量。

2.2.2樣品溶液的制備精確稱取脫脂后的生酸棗仁粉 1.0 g，置于100 mL三角瓶中，加入一定濃度適量乙醇溶液，浸泡45 min，超聲波提取，在5 000 r/min條件下，離心 15 min。旋蒸至1～2 mL，用95%乙醇定容至100 mL。將上述處理做3個平行。

2.2.3超聲波提取生酸棗仁中總黃酮單因素試驗分別以超聲波提取時間、超聲功率、料液比、乙醇濃度進行單因素試驗。

2.2.3.1超聲波提取時間單因素試驗選取不同的超聲時間（20、30、40、50、60、70 min），50 mL 50%的乙醇溶液，200 W功率，按“2.2.2”節(jié)操作。

2.2.3.2超聲功率單因素試驗選取不同的超聲功率（100、200、300、400、500 W），50 mL 50%的乙醇溶液，提取 20 min，按“2.2.2”節(jié)操作。

2.2.3.3料液比單因素試驗選取不同的料液比（1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70，g ∶mL），50%的乙醇溶液，提取20 min，200 W功率，按“2.2.2”節(jié)操作。

2.2.3.4乙醇濃度單因素試驗選取不同的乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%），50 mL乙醇溶液，提取 20 min，200 W功率，按“2.2.2”節(jié)操作。endprint

2.2.4響應面法優(yōu)化提取條件在單因素考察的基礎上采用響應面法試驗設計對影響提取的因素（超聲波提取時間、超聲功率、料液比、乙醇濃度）進行優(yōu)化，以生酸棗仁中總黃酮提取量為評價指標，采用響應面試驗設計軟件進行試驗設計，按表1、表2進行設計，篩選生酸棗仁中總黃酮提取的最佳工藝條件。

2.2.6提取次數(shù)的確定和最終得率計算選取本試驗條件下最佳提取工藝，確定提取次數(shù)并計算總黃酮得率。結果與模擬結果比較，預測所建立的酸棗仁總黃酮提取工藝是否合理。

2.2.7HPLC法測定酸棗仁斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素的樣品前處理按上述試驗所得的最佳試驗條件對生酸棗仁中的總黃酮進行提取，得到總黃酮提取液，濃縮至10 mL，經0.22 μm微孔濾膜過濾，用于HPLC法測定。

2.2.8HPLC分析條件色譜柱：COSMOSIL C18色譜柱

2.2.9標準溶液的配制與曲線的繪制精確稱取1.00 mg斯皮諾素和1.00 mg 6-阿魏酰斯皮諾素，溶解于1 mL甲醇中，配置成濃度為1 mg/mL的儲備液。精確吸取儲備液，分別稀釋成500、400、300、200、100、50 μg/mL，置于樣品瓶中，4 ℃ 保存。按照上述色譜條件進行HPLC法測定，以標準溶液濃度（X）為橫坐標，以峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，進行直線回歸，得到回歸方程。

3結果與分析

3.1超聲波提取單因素試驗

3.1.1超聲波提取時間對生酸棗仁中總黃酮提取量的影響由圖1可知，生酸棗仁在不同的超聲波提取時間下測得的吸光度不同。在所選的水平中生酸棗仁中總黃酮的提取量呈現(xiàn)先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢，其中在60 min時吸光度達到最大值。所以，基于本單因素試驗結果，選擇超聲時間60 min作為本試驗條件下最優(yōu)提取時間。

3.1.2超聲功率對生酸棗仁中總黃酮提取量的影響由圖2可知，生酸棗仁在不同的超聲功率下測得的吸光度有所不同。在所選的水平中生酸棗仁中總黃酮的提取量呈現(xiàn)先上升后下降，最后趨于不變的趨勢，其中在200 W時吸光度達到最大值。所以，基于本單因素試驗結果，選擇200 W作為本試驗條件下最佳提取功率。

3.1.3料液比對生酸棗仁中總黃酮提取量的影響由圖3可知，生酸棗仁在不同的料液比下測得的吸光度有所不同。在所選的水平中，生酸棗仁中總黃酮的含量呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢，其中在1 g ∶50 mL時吸光度達到最大值。所以，基于本單因素試驗結果，選擇1 g ∶50 mL作為本試驗條件下最佳提取料液比。

3.1.4乙醇濃度對生酸棗仁中總黃酮提取量的影響由圖4可知，生酸棗仁在不同的乙醇濃度下測得的吸光度有所不同。在所選的水平中生酸棗仁中總黃酮的提取量呈先上升后下降的趨勢，其中在乙醇濃度為50%時，吸光度達到最大值。所以，基于本單因素試驗結果，選擇50%乙醇作為本試驗條件下最佳的提取溶液。

3.2響應面法試驗設計分析

生酸棗仁總黃酮的響應面試驗結果見表2。利用Design-Expert 8.0.5.0軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到表4。由表4可知，回歸模型具有高顯著性（P<0.001）。一次項A、C、D，二次項A2、B2、C2、D2，交互項AD、BC都表現(xiàn)出極顯著影響。該模型的R2=0.990 5、R2Adj=0.981 1，表明該模型能解釋98.11%響應值的變化，擬合程度良好，試驗誤差小，適合對生酸棗仁總黃酮的提取量進行分析和預測；從模型的失擬性方差分析可以看出，失擬項為 0.066，不顯著（P>0.05），表明該模型是穩(wěn)定的，能很好地預測實際生酸棗仁中總黃酮含量的變化。通過F值大小可看出，影響生酸棗仁中總黃酮提取率的主次因素依次為C>A>D，即乙醇濃度>超聲功率>超聲時間。

采用逐步回歸法得到超聲功率、超聲時間、料液比、乙醇濃度4個影響因素與提取總黃酮的擬合方程：總黃酮含量=6.39+0.14A+0.000 083 33B+0.27C-0.11D-0.044AB+0.035AC+0.049AD-0.31BC-0.074BD+0.13CD-0.84A2-044B2-044C2-0.74D2。由響應面分析得出的優(yōu)化結果，超聲功率269.94 W，料液比48.3 ℃，乙醇濃度53.91%，超聲時間59.95 min。按照模型給出的近似適宜提取條件（超聲功率270 W，料液比1 g ∶50 mL，乙醇濃度50%，超聲時間 60 min）進行驗證試驗，每個處理3次平行，得到生酸棗仁總黃酮的含量為（6.37±0.16）mg/g，略低于前人的試驗結果（8.64 mg/g）[16]，這可能跟原料有關，與模型的理論差值為（0.12±0.01）mg/g。

3.4色譜條件的優(yōu)化

3.4.1檢測波長的選擇依據(jù)斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素的理化性質，它們在紫外區(qū)域有最大吸收，故取斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素對照品溶于甲醇后在200～400 nm波長范圍內進行掃描，結果顯示斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素在335 nm波長處具有最大吸收，所以選取335 nm作為HPLC法測定斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素含量的檢測波長。

3.4.2流動相的選擇色譜甲醇的最大吸收波長為 210 nm，色譜乙腈的最大吸收波長為190 nm，斯皮諾素和 6-阿魏酰斯皮諾素的最大吸收波長在335 nm，為減少干擾，提高信噪比，選擇乙腈作為流動相，可在消除背景干擾且保證基線較平穩(wěn)和檢測的靈敏度。試驗過程中在流動相中加入甲酸可減少色譜峰拖尾的情況，所以最終選擇加入了甲酸的乙腈-水體系。

3.4.3流動相組成的選擇流動相中有機相的比例越大，色譜峰的保留時間越短，色譜峰出峰越快。本試驗在其他相同條件下，分別試驗了乙腈的不同體積百分比下進標準溶液和樣品溶液的分析。結果顯示，表3的洗脫程序下標準品和樣品的分離效果最好，所以選擇本洗脫程序。endprint

3.4.4流動相流速的選擇在色譜分離過程中，流動相的流速大時，色譜柱柱壓升高，縮短了色譜柱的壽命。系統(tǒng)壓力增加，增大了泵的負荷，使泵損壞加快。流速過低， 待分離物質

3.6HPLC 分析方法的評價

3.6.1方法的精密度和穩(wěn)定性試驗取斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素混合標準溶液10 μL，在相同色譜條件下平行5次進樣，以色譜峰的峰面積為指標計算RSD，考察方法的精密度，斯皮諾素標準溶液的精密度試驗RSD為0.49%，6-阿魏酰斯皮諾素標準溶液的精密度試驗RSD為2.67%，說明本方法具有良好的精密度；將混合標準溶液在室溫放置2、4、8、16、32 h后進行HPLC測定，以色譜峰的峰面積為指標計算RSD，考察其穩(wěn)定性，斯皮諾素標準溶液的穩(wěn)定性試驗RSD為0.82%，6-阿魏酰斯皮諾素標準溶液的穩(wěn)定性試驗RSD為3.45%，說明本方法具有良好的穩(wěn)定性。

3.6.2回收率試驗準確平行稱取5份生酸棗仁樣品按“22.8”節(jié)色譜條件分析。另將同一水平的斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素混合標準溶液添加到同一樣品中，在相同條件下進行分析測定，與未加標樣品進行含量比較，計算每份樣品的加標回收率，并進行統(tǒng)計。結果表明，斯皮諾素的平均回收率為99.96%，相對標準偏差為5.69%；6-阿魏酰斯皮諾素的平均回收率為100.11%，相對標準偏差為4.23%。

從方法評價的結果來看，此方法具有較好的精密度、穩(wěn)定性和準確度，可用于生酸棗仁中斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素的含量分析。

3.7樣品色譜圖和含量分析

按照“2.2.8”節(jié)所述分析方法對生酸棗仁中的斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素的含量進行分析，斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素標準品和樣品的色譜圖見圖8。

根據(jù)表5所給出的標準曲線及樣品中2種物質的峰面積計算得出生酸棗仁中斯皮諾素的含量為3.48 mg/g，6-阿魏酰斯皮諾素的含量為2.24 mg/g，略高于前人試驗結果[17]。

4結論

本試驗采用響應面試驗設計優(yōu)化總黃酮提取工藝。由響應面分析得出的優(yōu)化結果是：超聲功率270 W，料液比 1 g ∶50 mL，乙醇濃度50%，超聲時間60 min提取2次。此條件下生酸棗仁中總黃酮提取量達6.37 mg/g。

本試驗開發(fā)了一種梯度淋洗高效液相色譜分析法，用于生酸棗仁中斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素的定量分析可以獲得比較滿意的分析結果。通過對生酸棗仁中斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素進行HPLC測定得出酸棗仁中中斯皮諾素的含量為3.48 mg/g，6-阿魏酰斯皮諾素的含量為 2.24 mg/g。

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