譚紅連+楊劍+尹丹+郝祝兵+韋英益+胡庭俊

摘要：首先通過MTT法檢測馬尾藻多糖對3D4/2細胞活性的影響，然后用ELISA法檢測炎癥相關因子。試驗結果，PCV-2感染3D4/2細胞后明顯降低細胞活性，馬尾藻多糖25、50、100、200、400 μg/mL處理后，均能提高感染細胞的活性；PCV-2感染3D4/2細胞后均能顯著提高TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、MCP-1等炎癥因子的水平，馬尾藻多糖處理后，25、50、100、200、400 μg/mL均能在一定程度上降低TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10、MCP-1的分泌水平，且其中25、50 μg/mL的效果最明顯。結果表明，馬尾藻多糖具有較好的體外抗炎作用，且其抗炎作用機制可能與其抑制炎癥因子IL-1β、IL-8、IL-10、TNF-α、MCP-1等的分泌有關。

關鍵詞：馬尾藻多糖；PCV-2；3D4/2細胞；炎癥因子

中圖分類號： S853.74文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）23-0166-03

收稿日期：2016-06-29

豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（porcine circovirus type Ⅱ，PCV-Ⅱ）是斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（postweaning mutisystenic wasting syndrome，PMWS）的主要致病原，已成為影響全球養(yǎng)豬業(yè)的重大疾病，導致巨大的經濟損失。PCV-Ⅱ病毒復制的主要場所是機體的單核-巨噬細胞和抗原遞呈細胞，PCV-Ⅱ感染后，病豬體內肺、肝、腎、扁桃體、胸腺、外周血單核細胞、支氣管淋巴結、腹股溝淋巴結中均能檢測到PCV-Ⅱ病毒核酸[4]，PCV-Ⅱ感染主要表現為淋巴細胞缺失和單核細胞浸潤等。本試驗就馬尾藻多糖對感染PCV-Ⅱ的3D4/2細胞增殖活性及炎癥相關細胞因子分泌的影響進行觀察，探討馬尾藻多糖抗炎作用分子機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒和細胞豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（SH株）（PCVⅡ）為南京農業(yè)大學農業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室分離保存，經PK-15細胞增殖后測得病毒滴度為104 TCID50/0.1 mL。豬肺泡巨噬細胞系3D4/2細胞由廣西大學動物科學技術學院預防獸醫(yī)學教研室提供。

1.1.2試驗藥物馬尾藻多糖，廣西大學動物科學技術學院藥理實驗室提供。

1.1.3主要儀器和試劑Multimode Plate Reader多功能酶標儀（TECAN）；RPMI 1640培養(yǎng)液（Gibc）；胎牛血清（Gibco）；噻唑藍MTT（索萊寶）；小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、白介素-10（IL-10）、巨噬細胞趨化蛋白-1（MCP-1）ELISA檢測試劑盒（欣博盛）。

1.2試驗方法

1.2.1馬尾藻多糖對PCV-2體外感染3D4/2細胞活性的影響分別設置細胞對照組、病毒對照組和6個不同藥物濃度組（25、50、100、200、400、800 μg/mL），當細胞密度至1×106 cell/mL時，接至96孔板，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2條件下過夜使其貼壁。細胞對照組加入無血清1640培養(yǎng)液 200 μL，病毒組及藥物組加入等量10-1PCV-2病毒液，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h，棄去病毒液，PBS緩沖液清洗3次后，細胞對照組、病毒對照組每孔加入100 μL含5% FBS-1640培養(yǎng)液，藥物組加入等量不同濃度SP繼續(xù)培養(yǎng) 8 h，用于檢測細胞活性。

1.2.2馬尾藻多糖對PCV-2體外感染3D4/2細胞炎癥相關因子的影響分別設置細胞對照組、病毒對照組和5個不同藥物濃度組（25、50、100、200、400 μg/mL），調節(jié)細胞濃度為1×106 cell/mL鋪于24孔板中，1 000 μL/孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)使細胞貼壁。棄上清，細胞對照組加入1 000 μL/孔培養(yǎng)液，病毒組、藥物組加入10-1 PCV-2病毒液1 000 μL/孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)2 h，棄上清，細胞對照組、LPS組、病毒對照組加入1 000 μL/孔培養(yǎng)液，藥物組分別加入不同濃度馬尾藻多糖，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)12 h，收集細胞上清液，用于 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、MCP-1等炎癥相關因子的檢測。

1.2.3MTT法檢測細胞活性按上述處理細胞培養(yǎng)3D4/2細胞8 h后，每孔吸棄10 μL上清，各組細胞每孔加入10 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結束后，棄掉孔內液體，每孔加入100 μL DMSO，搖勻，靜置10 min，置酶標儀上測定D570 nm值。

1.2.4ELISA法測定炎癥相關因子分泌水平按照上述處理后收集細胞上清，根據ELISA法檢測炎癥因子（IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、MCP-1）分泌水平，嚴格按照炎癥因子（IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、MCP-1）測定試劑盒說明進行操作。

1.3數據分析

試驗數據采用SSPS 18.0統計軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）。

2結果與分析

2.1不同濃度馬尾藻多糖對PCV-2體外感染3D4/2細胞12 h存活率的影響

由圖1可見，PCV-2感染3D4/2細胞明顯降低細胞活性，與細胞對照組相比差異極顯著（P<0.01）；加入馬尾藻多糖處理后，50、100、200、400 μg/mL馬尾藻多糖能提高感染3D4/2細胞活性，與病毒對照組相比差異極顯著（P<0.01）。表明馬尾藻多糖能顯著提高PCV-2感染3D4/2細胞活性。endprint

2.2不同濃度馬尾藻多糖對PCV-2體外感染3D4/2細胞TNF-α分泌的影響

由圖2可見，PCV-2感染3D4/2細胞后升高細胞TNF-α水平，與空白對照組相比差異極顯著（P<0.01）；加入馬尾藻多糖處理后，與病毒對照組相比，25、50、100 μg/mL馬尾藻多糖能極顯著降低TNF-α水平（P<0.01）；200 μg/mL馬尾藻多糖能顯著降低TNF-α水平（P<0.05）；400 μg/mL馬尾藻多糖能降低TNF-α水平，但差異不顯著（P>0.05）。

2.3不同濃度馬尾藻多糖對PCV-2體外感染3D4/2細胞IL-1β分泌的影響

由圖3可見，PCV-2感染3D4/2細胞后升高細胞IL-1β水平，與空白對照組相比差異極顯著（P<0.01）；加入馬尾藻多糖處理后，與病毒對照組相比，25、50 μg/mL馬尾藻多糖能極顯著降低IL-1β水平（P<0.01），100、400 μg/mL馬尾藻多糖能降低IL-1β水平，但差異不顯著（P>0.05）。

2.4不同濃度SP對PCV-2體外感染3D4/2細胞IL-6分泌的影響

由圖4可見，PCV-2感染3D4/2細胞后升高細胞IL-6水平，與空白對照組相比差異顯著（P<0.05）；加入馬尾藻多糖處理后，與病毒對照組相比，25 μg/mL馬尾藻多糖降低 IL-6水平，但差異不顯著（P>0.05）；50、100、200、400 μg/mL 馬尾藻多糖均能顯著或極顯著升高IL-6水平（P<0.05，P<0.01）。

2.5不同濃度馬尾藻多糖對PCV-2體外感染3D4/2細胞IL-8分泌的影響

由圖5可見，PCV-2感染3D4/2細胞后升高細胞IL-8水平，與空白對照組相比差異極顯著（P<0.01）；加入馬尾藻多糖處理后，與病毒對照組相比，25、50、100 μg/mL馬尾藻多糖能極顯著降低IL-8水平（P<0.01）；200 μg/mL SP能顯著降低IL-8水平（P<0.05）；400 μg/mL馬尾藻多糖能降低IL-8水平，但差異不顯著（P>0.05）。

2.6不同濃度馬尾藻多糖對PCV-2體外感染3D4/2細胞IL-10分泌的影響

由圖6可見，PCV-2感染3D4/2細胞后升高細胞IL-10水平，與空白對照組相比差異極顯著（P<0.01）；加入馬尾藻多糖處理后，與病毒對照組相比，25、50 μg/mL馬尾藻多糖能極顯著或顯著降低IL-10水平（P<0.01，P<0.05），100、200、400 μg/mL馬尾藻多糖能降低IL-10水平，但差異不顯著（P>0.05）。

2.7不同濃度馬尾藻多糖對PCV-2體外感染3D4/2細胞MCP-1分泌的影響

由圖7可見，PCV-2感染3D4/2細胞后升高細胞 MCP-1水平，與空白對照組相比差異不顯著（P>0.05）；加入馬尾藻多糖處理后，與病毒對照組相比，25、50、100、200 μg/mL 馬尾藻多糖能降低MCP-1水平但差異不顯著（P>0.05）。

3討論

多糖、皂苷類和黃酮等是中藥的有效成分，具有促進細胞生長、參與免疫調節(jié)等功效。炎癥是機體受到各種致炎因素的刺激和損傷后，為滅活及移除這些致炎因素并為組織修復創(chuàng)造環(huán)境而產生的防御性反應，是一種十分常見而又重要的基本病理過程，是許多疾病的癥狀或并發(fā)癥，可引起局部或全身性反應。炎癥主要由細菌和病毒引起，也可因物理、化學、外傷等刺激而產生[5-7]。在炎癥反應中，巨噬細胞起著重要作用，是體內啟動炎癥介質產生的中心細胞，活化的巨噬細胞是參與炎癥反應的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、MCP-1等細胞因子的重要來源[8-9]，為調控炎癥反應的主要細胞，由炎癥反應所致免疫防御和免疫功能紊亂過程中，巨噬細胞是一個關鍵的參與者。

在本試驗中，PCV-2感染3D4/2細胞后顯著促進了TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、MCP-1等炎癥因子的分泌，而用馬尾藻多糖處理后，25、50、100、200、400 μg/mL馬尾藻多糖均在一定程度上抑制了TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10、MCP-1等炎癥因子的分泌，其中20、50 μg/mL效果較明顯。

4結論

馬尾藻多糖能顯著提高PCV-2感染的3D4/2細胞活性，具有較好的體外抗炎作用，且其抗炎作用機制可能與其抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10、MCP-1等的分泌有關。

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