郭建軍+曾靜+袁林+邱小忠

摘要：為了獲得多角體包裹的重組豬α干擾素，應用Bac-to-Bac昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng)，將多角體蛋白基因和編碼成熟豬α干擾素的基因分別構建到pFastBac Dual載體的PH、P10啟動子下，以多角體蛋白H1 α-螺旋序列為信號肽。將構建質粒轉化DH10BacTM感受態(tài)細胞進行同源重組，經抗性和藍白斑篩選，獲得重組穿梭質粒Bacmid，轉染Sf9昆蟲細胞獲得重組病毒。通過間接免疫熒光、Western-Blot證明，多角體蛋白與豬α干擾素實現(xiàn)共表達，在信號肽引導下豬α干擾素被包埋進多角體；用微量細胞病變抑制法檢測顯示，多角體包裹的豬α干擾素有抗病毒活性，效價達到5億U/mg以上。應用在昆蟲細胞中表達的多角體包裹型豬α干擾素，在臨床上為豬病毒性疾病的防治與治療奠定了基礎。

關鍵詞：豬干擾素；多角體；桿狀病毒表達；抗病毒活性

中圖分類號： Q786文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）23-0041-04

是人和動物細胞受到特定干擾素誘生劑刺激后，產生的一種具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)等多種功能的細胞因子[1-2]，是現(xiàn)今最理想的一種抗病毒生物制劑[3]。豬α干擾素（porcine interferon，簡稱PoIFNα）屬于干擾素Ⅰ型，機體的多種體細胞受病毒感染時均可產生豬α干擾素，具有較強的抗病毒作用[4-5]。PoIFNα基因全長570 bp，編碼含189個氨基酸殘基的前體蛋白，其中前23個氨基酸為信號肽，其后的166個氨基酸為成熟的豬α干擾素蛋白[1-2]。豬α干擾素主要由單核細胞產生，有多個亞型，各亞型結構相似，其活體形式為單體。大量試驗表明，豬α干擾素對豬繁殖與呼吸綜合征病毒[6-7]、口蹄疫病毒[8]和豬傳染性胃腸炎病毒[9]等具有抑制作用。

多角體是由同源結合的多角體蛋白分子三聚體相互作用組裝成的致密蛋白晶體形成的，多角體能夠有效保護包埋的異源蛋白免受外界物理和生物化學作用的降解[10-11]，保持異源蛋白的穩(wěn)定性和生物學功能，使其具有抗輻射、抗高溫、持久緩釋等作用[12]。Ikeda等將目的蛋白基因與多角體蛋白基因共表達，且目的蛋白被包埋進多角體蛋白內[13]；在不良環(huán)境刺激下，受多角體保護的外源蛋白在較長時間內保持活性。Mori等利用多角體蛋白將成纖維細胞生長因子Ⅱ固定入多角體中并成功檢測了其穩(wěn)定性和生物活性[14]。

利用昆蟲病毒Bac-to-Bac表達系統(tǒng)，以多角體蛋白氨基端的H1 α-螺旋序列作為多角體蛋白識別信號序列與豬α干擾素融合，將多角體蛋白基因和含豬α干擾素融合基因分別構建到pFastBac Dual載體的PH、P10啟動子下，實現(xiàn)多角體蛋白與豬α干擾素共表達，在信號肽引導下自我組裝，將豬α干擾素包埋入多角體內，以期獲得高效、穩(wěn)定、廣譜抗病毒活性的多角體包裹型干擾素制劑，為豬病毒性疾病的防治與治療提供新的解決方案。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1質粒和宿主菌多角體基因polyh和豬干擾素PoIFNα完整基因連接在pUC57載體上的克隆質粒，由江西省生物化工工程技術中心保存；桿狀病毒轉移載體pFastBacDual，購自Invitrogen公司；大腸桿菌DH5α、DH10BacTM，由江西省科學院微生物研究所分子生物學研究室保存。

1.1.2試劑限制性內切酶為Fermentas公司產品；高保真DNA聚合酶、dNTPs、DNA凝膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶、MiniBest Bacterial Genomic DNA Extraction Kit等，購自TaKaRa公司；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒，購自武漢博士德生物工程有限公司。鼠抗豬干擾素α一抗為Santa Cruz公司的產品，異硫氰酸熒光素（FITC）標記的羊抗鼠IgG購自北京中杉生物技術公司，辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG購自Sigma公司。蛋白質標準分子質量marker，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.1.3細胞和病毒Sf9昆蟲細胞、Vero細胞和水皰性口炎病毒（VSV）-綠色熒光蛋白（GFP）（能表達GFP的重組水皰性口炎病毒），由浙江大學農業(yè)部動物疫病病原學與免疫控制重點開放實驗室保存。

Sf 9細胞由筆者所在研究室繼代保存。用Gracés+10%胎牛血清（FBS）于28 ℃培養(yǎng)；Gracés培養(yǎng)基、DMEM細胞培養(yǎng)基、轉染試劑Cellfectin Reagent和優(yōu)級胎牛血清，購自GiBCO公司。

1.2試驗方法

1.2.1共表達轉移載體的構建以GenBank中已發(fā)表的多角體基因polyh（登錄號：GQ924589）為基礎，在上、下游引物中分別添加BamHⅠ、NotⅠ位點，由上海捷瑞生物工程有限公司合成并插入pUC57載體形成質粒pUC57-polyh。用BamHⅠ/NotⅠ雙酶切將polyh基因從pUC57載體上切下來，經過膠回收純化，構建到pFastBacDual載體PH啟動子下游相應的位點，連接產物轉化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆進行測序驗證，獲得多角體表達載體pPH。

以GenBank中已發(fā)表的豬α干擾素（登錄號：ABB51633）為基礎，對原始序列的GC含量、限制性內切酶和密碼子偏好性等方面進行優(yōu)化，并在優(yōu)化后的基因序列的5′端加入XhoⅠ位點、H1信號肽和柔性連接肽kozak序列，3′端加入KpnⅠ位點，然后由上海捷瑞生物工程有限公司合成并插入pUC57載體形成質粒pUC57-PoIFNα。將H1-PoIFNα片段用XhoⅠ/KpnⅠ從pUC57上酶切下來，經過膠回收純化，構建到pPH載體P10啟動子下游相應的位點，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆測序驗證，獲得多角體基因polyh與豬α干擾素基因PoIFNα共表達轉移載體 pPH-PoIFNα。endprint

1.2.2表達rPoIFNα重組桿狀病毒的構建與鑒定利用AcMNPV Bac-to-Bac系統(tǒng)，根據產品說明書構建重組桿狀病毒質粒（簡稱Bacmid，Invitrogen公司）：分別將共表達轉移載體pPH-PoIFNα和多角體表達載體pPH轉化E.coli DH10BacTM感受態(tài)細胞，將菌液涂于含有X-gal（40 μg/mL）、IPTG（24 μg/mL）、卡那霉素（50 μg/mL）、慶大霉素（100 μg/mL）和四環(huán)素（30 μg/mL）的培養(yǎng)基平板上，經藍白斑篩選，提取質粒進行鑒定。采用Cellfectin Reagent將rBacmid-polyh-PoIFNα轉染對數生長期的Sf9昆蟲細胞，細胞出現(xiàn)病變，提取重組桿狀病毒基因組DNA，用M13引物（M13-F：5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′；M13-R：5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′）進行PCR擴增特異性片段，鑒定重組桿狀病毒。

1.2.3間接免疫熒光檢測rPoIFNα的表達用鑒定正確的穿梭質粒rBacmid-polyh-PoIFNα接種對數生長期的Sf9昆蟲細胞，28 ℃培養(yǎng)72 h，至出現(xiàn)形態(tài)病變時，收獲細胞，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌后，將懸液滴于載玻片上，自然干燥，用預冷的丙酮-乙醇（3 ∶2）固定5 min。以鼠抗PoIFNα抗體（1 ∶2 500）作一抗，用FITC標記的羊抗鼠抗體（1 ∶250）作二抗，用熒光顯微鏡觀察結果。同時以rBacmid-polyh感染的細胞作對照。

1.2.4十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）和Western Blot檢測rPoIFNα的表達用上述rBacmid-polyh-PoIFNα接種對數生長期的Sf9昆蟲細胞，用30 mL PBS懸浮后用超聲波破碎，15 000 r/min離心收集多角體。將Percoll與PBS按9 ∶1的體積比混合，調節(jié)pH值至7.2，12 000 r/min 離心20 min收集純凈的多角體。最后將純化的多角體懸浮于含有0.1% SDS的0.01 mmol/L PBS緩沖液（pH值7.2）中，室溫放置5 min，然后用PBS洗滌2次得到最終純化的多角體。

對上述純化的多角體進行SDS-PAGE電泳，電轉印至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，用含10%脫脂乳的PBST封閉過夜，以鼠抗pIFN-α（1 ∶500）作為一抗，作用2 h，用PBST洗滌，后用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG（1 ∶2 500）作二抗，作用1 h，用二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒檢測。

1.2.5豬α干擾素的抗病毒活性測定參照文獻[4-5]的方法，在Vero/VSV·GFP系統(tǒng)上采用微量細胞病變抑制法測定多角體包裹的豬α干擾素的抗病毒活性。熒光倒置顯微鏡下觀察GFP表達及病毒感染復制情況。以VSV-GFP病毒對照組細胞完全出現(xiàn)病變（即熒光數量為100%）為標準判定干擾素抗病毒活性，將能抑制50%細胞病變的樣品最高稀釋度定義為1個抗病毒活性單位。

2結果與分析

2.1多角體與PoIFNα共表達轉移載體pPH-PoIFNα的構建

對重組質粒pPH-PoIFNα用BamHⅠ/NotⅠ、XhoⅠ/KpnⅠ進行酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，酶切產物小片段與預期大小相符，大片段與載體大小相符，詳見如圖1。結果表明，多角體蛋白基因插入到載體pFastBac Dual質粒PH啟動子下的BamHⅠ和NotⅠ之間；豬α干擾素基因已成功插入到載體pFastBac Dual質粒P10啟動子的XhoⅠ和KpnⅠ之間。酶切鑒定正確后，對相應質粒進行核酸測序。

用MegAlign程序比對表明，設計在豬α干擾素蛋白N端的融合H1信號肽和柔性連接肽kozak序列組成PoIFNα基因及多角體蛋白基因序列與測序結果序列完全正確，且讀碼框正確，表明多角體基因polyh與豬α干擾素基因PoIFNα共表達轉移載體pPH-PoIFNα構建成功。

2.2豬α干擾素在昆蟲細胞中的表達

用pPH-PoIFNα質粒轉化AcMNPV Bac-to-Bac系統(tǒng)的E.coli DH10BacTM感受態(tài)細胞，得到同時表達polyh、PoIFNα基因的重組rBacmid-polyh-PoIFNα。rBacmid-polyh-PoIFNα用M13F、M13R引物進行PCR鑒定和測序比對分析，表明豬α干擾素PoIFNα基因片段插入至正確位置。

用重組子rBacmid-polyh-PoIFNα轉染Sf9細胞48 h后，細胞出現(xiàn)病變，細胞內充滿顆粒，細胞附著力減弱，開始脫壁上浮并且個別細胞解體成顆粒狀物散落至細胞培養(yǎng)液中，而正常細胞中沒有發(fā)現(xiàn)多角體顆粒。間接免疫熒光試驗結果顯示，rBacmid-polyh-PoIFNα感染Sf9昆蟲細胞顯示強熒光信號，而以rBacmid-polyh感染Sf9昆蟲細胞熒光信號呈陰性（圖2），表明 rPoIFNα在Sf9昆蟲細胞中獲得表達。

2.3多角體包裹型豬干擾素的形成及驗證

用重組子rBacmid-polyh-PoIFNα轉染Sf9細胞48 h后，在顯微鏡下觀察可見細胞多呈圓形，生長狀態(tài)較差，細胞質內可觀察到少量具有強折光性的結晶顆粒；繼續(xù)培養(yǎng)后，細胞出現(xiàn)病變，細胞內充滿顆粒，細胞附著力減弱，開始脫壁上浮并且個別細胞解體成顆粒狀物散落至細胞培養(yǎng)液中，而正常細胞中沒有發(fā)現(xiàn)多角體顆粒。

以重組Bacmid感染的細胞為陰性對照，用重組 rBacmid-polyh 和重組rBacmid-polyh-PoIFNα感染昆蟲細胞Sf9。培養(yǎng)96 h后，收獲感染的細胞。超聲波破碎細胞，離心收集多角體。SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)，重組rBacmid-polyh和重組rBacmid-polyh-PoIFNα感染昆蟲細胞Sf9后，有1條相同大小的條帶，與預測的多角體蛋白分子量一致，重組rBacmid-polyh-PoIFNα感染昆蟲細胞Sf9后，在19 ku處還出現(xiàn)條帶（圖3-A）。endprint

重組豬干擾素rPoIFNαSDS-PAGE結果顯示，在19 ku處出現(xiàn)1條帶，轉膜后以鼠抗PoIFNα抗體為一抗，用HRP標記的羊抗鼠IgG作二抗進行免疫印跡檢測。由圖3-B可見，Western Blot檢測出現(xiàn)1條特異性的抗原-抗體結合帶，進一步驗證多角體包埋的蛋白為豬干擾素。

2.4多角體包裹型豬干擾素抗病毒活性的檢測

用微量細胞病變抑制法在Vero/VSV·GFP系統(tǒng)上進行豬α干擾素抗病毒活性測定。在倒置熒光顯微鏡下觀察可

見，細胞對照組中的細胞仍完全良好生長，無熒光出現(xiàn)，病毒對照組各孔中幾乎100%細胞出現(xiàn)熒光，且有細胞病變。VSV·GFP在Vero細胞中的繁殖情況與綠色熒光蛋白的表達呈正相關，以熒光細胞數為病毒對照孔50%的最高稀釋度為干擾素的效價。抗病毒活性測定結果表明，多角體包裹型豬α干擾素有較為明顯的抗病毒活性，效價能達到 5億U/mg 以上。

3討論

豬PoIFNα作為廣譜抗病毒的細胞因子，具有高效、無藥物殘留、無副作用[1-2]等優(yōu)點，屬于新型蛋白質類獸藥，對多種豬傳染性病毒病具有一定的防治效果，在養(yǎng)豬業(yè)中應用前景廣闊[6]。用白細胞生產干擾素，效果確切，但價格昂貴。體外表達PoIFNα進行免疫增強作用和抗病毒作用等[5-9]相關研究已有報道，利用酵母表達干擾素，其表達量極低[15]。至今，人們已用大腸桿菌[16]、酵母[15]、哺乳動物細胞[17]和昆蟲桿狀病毒[4-5]等表達系統(tǒng)表達過豬干擾素，從表達產物的抗病毒活性來看，真核表達產物要好于原核表達產物。

本研究利用昆蟲病毒Bac-to-Bac表達系統(tǒng)，以多角體蛋白氨基端的H1 α-螺旋序列作為多角體蛋白識別信號序列，信號序列和豬α干擾素融合，將多角體蛋白基因和含豬α干擾素融合基因分別構建到pFastBac Dual載體的PH、P10啟動子下，通過與病毒骨架重組，獲得重組昆蟲病毒，多角體蛋白和豬α干擾素在昆蟲細胞中共表達。預測重組蛋白PoIFNα分子量為19 ku，SDS-PAGE電泳結果顯示，在此位置有明顯條帶。Western Blot結果表明，表達的豬α干擾素rPoIFNα具有免疫學活性。

Mori等利用改良的桿狀病毒表達載體，在培養(yǎng)的昆蟲細胞內進行BmCPV多角體蛋白基因的體外表達，結果表明，BmCPV的多角體蛋白可以進行自我包裝，在沒有其他病毒因子的存在下能夠組裝成多角體晶體結構[14]。研究還發(fā)現(xiàn)，多角體不僅可以對異源病毒粒子進行包裝，還可以對一些異源蛋白進行包埋[18]。Ijiri等將蛋白激酶C包裹進質型多角體中，并發(fā)現(xiàn)包裹型的蛋白激酶C相對于沒有經過包裹的蛋白有更強生物學活性和持續(xù)的藥物緩釋效果[19]。

本研究成功構建了共表達多角體蛋白基因和豬α干擾素基因的重組桿狀病毒。為了實現(xiàn)豬α干擾素被多角體蛋白包埋，形成多角體包裹的豬α干擾素。筆者在構建桿狀病毒轉移載體時引入以多角體蛋白氨基端的H1 α-螺旋序列作為多角體蛋白識別信號序列，將要表達的豬α干擾素基因連接在H1 α-螺旋序列3′端。PH啟動子和P10啟動子均是桿狀病毒的極晚期啟動子，具有極強的表達效率，并且相互之間無干擾性[20]，本研究將多角體蛋白基因和含豬α干擾素融合基因分別構建到pFastBac Dual載體的PH啟動子和P10啟動子下，實現(xiàn)多角體蛋白與豬α干擾素共表達，在信號肽引導自我組裝下將豬α干擾素包埋進多角體蛋白內，使被多角體包裹的豬α干擾素保持穩(wěn)定的抗病毒活性。

用微量細胞病變抑制法在Vero/VSV·GFP系統(tǒng)上進行豬干擾素抗病毒活性測定，用VSV·GFP代替野生型VSV具有快速簡單、靈敏度高的特點[21]?？共《净钚詼y定結果表明，多角體包裹豬干擾素α有較為明顯的抗病毒活性，為進一步進行動物試驗提供了物質基礎。多角體包裹豬干擾素α結合了豬干擾素α在抗病毒方面的優(yōu)點及多角體具有的耐酸、抗高溫、持久緩釋等特性的優(yōu)勢，這些特性很可能使表達產物在豬病毒性疾病的臨床治療和預防中發(fā)揮更優(yōu)越的效果。

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