張桂芳+劉靜+劉春+張黎

摘要：以白鶴芋的花序?yàn)橥庵搀w，研究不同外源激素濃度、外植體的不同發(fā)育時(shí)期、花序取材部位及不同光周期培養(yǎng)條件對(duì)花序體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響，擬篩選出體胚誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，最優(yōu)白鶴芋花序體胚誘導(dǎo)方案如下：以白鶴芋盛花期花序?yàn)橥庵搀w，用0.1%氯化汞溶液滅菌10 min，接種于MS+5.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)15 d后轉(zhuǎn)到光—暗周期為12 h—12 h的條件下培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞：白鶴芋；花序；體細(xì)胞胚；體胚誘導(dǎo)

中圖分類(lèi)號(hào)： Q945.51文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）23-0038-03

收稿日期：2016-07-06

基金項(xiàng)目：寧夏科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目子課題（編號(hào)：GIP201648）。

作者簡(jiǎn)介：張桂芳（1988—），女，山西大同人，碩士研究生，主要從事觀賞植物研究。E-mail：544406790@qq.com。

通信作者：張黎，教授，主要從事觀賞園藝研究。E-mail：zhang_li9988@163.com。白鶴芋（Spathiphylium）別稱(chēng)苞葉芋、白掌、和平芋，為天南星科白鶴芋屬多年生草本花卉。白鶴芋廣泛應(yīng)用于盆栽觀賞，被視為“清白之花”，有純潔、安泰、一帆風(fēng)順之意[1]，是理想的花葉兼賞花卉，深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)，其市場(chǎng)需求量逐年增加，白鶴芋主要通過(guò)組織快繁技術(shù)來(lái)滿(mǎn)足其市場(chǎng)需求。體細(xì)胞胚胎繁殖技術(shù)是組織培養(yǎng)中一種高效的快繁技術(shù)，對(duì)于白鶴芋的組織培養(yǎng)，多集中在其器官發(fā)生，關(guān)于其體胚誘導(dǎo)的研究較少，最早的是周麗儂等于1995年對(duì)花序體胚再生途徑的研究[2]。本試驗(yàn)以白鶴芋花序?yàn)橥庵搀w，研究花序取材時(shí)期、取材部位及激素濃度等對(duì)體胚誘導(dǎo)的影響，以期為白鶴芋的體胚誘導(dǎo)提供依據(jù)。

1材料與方法1.1試驗(yàn)材料

以白鶴芋品種美酒的花序?yàn)橥庵搀w材料，取自寧夏銀川市寧夏園藝產(chǎn)業(yè)園。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1不同發(fā)育時(shí)期白鶴芋花序滅菌處理試驗(yàn)設(shè)不同白鶴芋花序發(fā)育時(shí)期的處理，分別為花苞期（即初花期，佛焰苞被完全包裹）（圖1-A）、盛花期（佛焰苞完全開(kāi)放）（圖1-B）、末花期（佛焰苞及花序轉(zhuǎn)為綠色）（圖1-C）。將外植體用自來(lái)水沖洗30～60 min后，用75%乙醇處理30 s，然后用無(wú)菌水沖洗2～3遍，再然后用0.1% HgCl2溶液分別處理8、10、12 min，最后用無(wú)菌水沖洗2～3遍。將處理后的花序接種于不添加激素的MS培養(yǎng)基中，每個(gè)處理設(shè)20個(gè)外植體，試驗(yàn)重復(fù)3次。接種20 d后，統(tǒng)計(jì)污染率，30 d后統(tǒng)計(jì)褐變率、無(wú)菌體獲得率。

1.2.2白鶴芋花序體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)試驗(yàn)白鶴芋體細(xì)胞胚胎的誘導(dǎo)培養(yǎng)基選擇6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、噻苯隆（TDZ）和萘乙酸（NAA）3種激素，設(shè)3個(gè)水平（表1）進(jìn)行正交試驗(yàn)，共9個(gè)處理（表2），每個(gè)處理20瓶，試驗(yàn)重復(fù)3次。以MS為基本培養(yǎng)基，附加30 g/L蔗糖，6 g/L瓊脂，pH值58。將滅菌后成活的花序橫切為1.0～1.5 mm的薄片，接種于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每瓶接種5個(gè)。培養(yǎng)50 d后，統(tǒng)計(jì)體胚誘導(dǎo)率及體胚的生長(zhǎng)情況。

1.2.4光周期對(duì)花序體胚的誘導(dǎo)試驗(yàn)在不同光周期條件下進(jìn)行體胚誘導(dǎo)試驗(yàn)，設(shè)3種方式：T1處理，黑暗條件下培養(yǎng)15 d后，轉(zhuǎn)到光—暗周期為12 h—12 h的條件下培養(yǎng)；T2處理，始終在光—暗周期為12 h—12 h的條件下培養(yǎng)；T3處理，全暗條件下培養(yǎng)。在確定最佳體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，將花序接種到最佳體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)20、30、40、50、60 d后觀察并統(tǒng)計(jì)褐變率、誘導(dǎo)率。每個(gè)處理20瓶，重復(fù)3次。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及處理相關(guān)公式如下：

污染率=（污染的花序數(shù)/接種的花序外植體總數(shù)）×100%；

褐變率=（發(fā)生褐變的花序數(shù)/接種的花序外植體總數(shù)）×100%；

無(wú)菌花序獲得率=[（接種的花序總數(shù)-污染的花序數(shù)-死亡的花序數(shù)）/接種的花序外植體總數(shù)]×100%；

體胚誘導(dǎo)率=（生成初級(jí)體胚花序數(shù)/接種的花序外植體總數(shù)）×100%。

采用DPS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1滅菌處理對(duì)不同發(fā)育時(shí)期白鶴芋花序污染率的影響

用0.1% HgCl2溶液對(duì)白鶴芋花苞期、盛花期、末花期花序進(jìn)行不同時(shí)間的滅菌試驗(yàn)。如表3所示，當(dāng)花苞期的滅菌時(shí)間為8 min時(shí)，無(wú)菌花序獲得率最高，為50.34%。盛花期花序在滅菌時(shí)間為10 min的處理下，污染率為26.67%，無(wú)菌花序獲得率達(dá)64.44%，即最適宜的滅菌時(shí)間為10 min。末花期最適宜的滅菌時(shí)間為12 min，其無(wú)菌花序獲得率達(dá)4778%。各個(gè)花期的褐變率都隨著滅菌時(shí)間的增加而提高，且在相同的滅菌時(shí)間下，褐變率排序?yàn)榛ò?盛花期>末花期。綜合比較褐變率和無(wú)菌花序獲得率可知，盛花期在最適宜的滅菌時(shí)間下，無(wú)菌花序獲得率最高，花苞期次之。

2.2不同激素濃度對(duì)初級(jí)體細(xì)胞胚直接誘導(dǎo)的影響

在初級(jí)體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中，9個(gè)處理的培養(yǎng)基都能誘導(dǎo)初級(jí)體胚的產(chǎn)生，但不同培養(yǎng)基中的初級(jí)體胚誘導(dǎo)率差異較大。處理1、處理2、處理3培養(yǎng)基中的花序在培養(yǎng)40 d后大部分都出現(xiàn)褐化及死亡的情況，只有極少部分花序能產(chǎn)生微小的黃綠色顆粒狀突起。隨著6-BA濃度的增加，處理 4至處理9在培養(yǎng)10 d后白色的花序均逐漸轉(zhuǎn)為綠色，并膨大。培養(yǎng)50 d后花序膨大至原來(lái)的2倍，處理4、處理5、處理6表面產(chǎn)生少量的黃綠色體胚，處理8花序表面形成大量緊密的簇狀體細(xì)胞胚。在解剖鏡下觀察，可清晰地看到黃綠色的球形胚（圖2-B）、梨形胚（圖2-C）、子葉形胚（圖2-D）和成熟體胚（圖2-E），在同一個(gè)花序上能觀察到不同發(fā)育時(shí)期的體胚（圖2-A）。endprint

9個(gè)處理間差異都極顯著，由K值和誘導(dǎo)率可知，處理8為白鶴芋花序初級(jí)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基，激素組合為5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA。由極差R可知，6-BA 對(duì)白鶴芋花序初級(jí)體胚誘導(dǎo)的影響最大，遠(yuǎn)大于TDZ、NAA，3種激素對(duì)初級(jí)體胚誘導(dǎo)效應(yīng)大小依次為 6-BA>TDZ>NAA（表4）。

2.3白鶴芋花序不同發(fā)育時(shí)期、不同取材部位對(duì)初級(jí)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響

由表5可以看出，花序體胚誘導(dǎo)率與發(fā)育時(shí)期、取材部位具有一定的相關(guān)性，體胚誘導(dǎo)率排序?yàn)槭⒒ㄆ?初花期>末花期，且盛花期體胚的誘導(dǎo)率明顯高于其他時(shí)期。同時(shí)期同花序的不同形態(tài)位置對(duì)體胚誘導(dǎo)有顯著影響，表現(xiàn)為花序下端>花序上端>花序中端。其中盛花期花序形態(tài)學(xué)下端的誘導(dǎo)率最高，達(dá)71.67%，且與其他處理差異極顯著。綜合體胚

2.4光周期變化對(duì)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響

由表6可知，3個(gè)處理均能誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚，但各處理間差異顯著。T1、T2處理較T3處理誘導(dǎo)率高， 生成體細(xì)胞胚數(shù)

量多。但在T3處理培養(yǎng)條件下，褐變率較T1、T2處理低。花序體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)在黑暗培養(yǎng)條件下較光照條件下晚，60 d時(shí)，花序在光—暗條件下的胚誘導(dǎo)率比在全黑暗培養(yǎng)下的體胚誘導(dǎo)率提高了20%以上。在體胚發(fā)育過(guò)程中觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)至20 d時(shí)部分花序上生成顆粒狀突起，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，顆粒狀突起逐漸膨大。當(dāng)培養(yǎng)到60 d時(shí)，T2處理體胚呈淡綠色略顯褐色，T3處理體胚呈黃白色，T1處理體胚呈黃綠色，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，T1處理體胚顏色逐漸變綠，且最為健康。因此可以得出，T1處理是體胚誘導(dǎo)最佳的光周期變化。

3結(jié)論與討論

3.1結(jié)論

對(duì)于不同發(fā)育時(shí)期的白鶴芋花序，用0.1%氯化汞溶液進(jìn)行滅菌處理可知，花苞期最佳滅菌時(shí)間為8 min，盛花期最佳滅菌時(shí)間為10 min，末花期最佳滅菌時(shí)間為12 min。在最佳滅菌時(shí)間下，無(wú)菌花序獲得率由高到低依次為盛花期>花苞期>末花期。

白鶴芋花序體胚誘導(dǎo)的各激素效應(yīng)大小依次為6-BA>TDZ>NAA，其中6-BA的影響最顯著。9個(gè)處理的培養(yǎng)基中，體胚誘導(dǎo)率差異較大，花序初級(jí)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)最優(yōu)激素組合為 5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA。

盛花期的花序?yàn)樽罴洋w胚誘導(dǎo)外植體，而且以盛花期的形態(tài)學(xué)下端的體胚誘導(dǎo)率最高。黑暗下培養(yǎng)15 d后轉(zhuǎn)到光—暗周期為12 h—12 h條件下培養(yǎng)為白鶴芋花序初級(jí)體胚誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)條件。

3.2討論

同一植物的不同發(fā)育時(shí)期及不同部位對(duì)外植體的滅菌效果具有一定的影響。高亦珂在試驗(yàn)中指出，百合鱗莖、鱗片滅菌效果排序依次為內(nèi)部>中部>外部[3]。百合內(nèi)部和中部鱗片被包裹，受到外界環(huán)境的污染小，因此滅菌效果較好。本研究在對(duì)白鶴芋不同發(fā)育時(shí)期花序進(jìn)行滅菌處理試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，白鶴芋花序的花苞期、盛花期的滅菌效果比末花期滅菌效果好。這是因?yàn)榛ò诘幕ㄐ蜉S被苞片包裹，盛花期的花序苞片展開(kāi)時(shí)間不長(zhǎng)，受外界環(huán)境影響程度小，而末花期的花序軸完全暴露，受外界環(huán)境影響大，易受損傷和受到細(xì)菌的侵染，滅菌難，污染率高。

在白鶴芋體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)中，MS培養(yǎng)基只保證白鶴芋花序的生存，只有生長(zhǎng)素及細(xì)胞分裂素濃度適宜的配比，才能誘導(dǎo)產(chǎn)生形態(tài)正常、數(shù)量多的體細(xì)胞胚。體胚的誘導(dǎo)通常需要較高濃度的細(xì)胞分裂素和較低濃度的生長(zhǎng)素或不需要生長(zhǎng)素[4-5]。周麗儂等研究認(rèn)為，含有高濃度6-BA的培養(yǎng)基有利于白鶴芋花序體細(xì)胞胚的直接誘導(dǎo)[2]。曹靜等通過(guò)研究得出，白鶴芋幼嫩花序培養(yǎng)在MS+4～5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA的培養(yǎng)基中，由花序表面直接發(fā)生體細(xì)胞胚胎[6]。鄺哲師等研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的6-BA有利于提高香蕉花序體胚直接發(fā)生頻率[7]。呂秀立等研究表明，誘導(dǎo)歐洲七葉樹(shù)體細(xì)胞胚產(chǎn)生的最佳培養(yǎng)是8 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+2 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L KT[8]。白鶴芋花序直接體胚誘導(dǎo)率與發(fā)育時(shí)期、取材部位具有一定的相關(guān)性。穆紅梅等以中國(guó)石蒜花苞期、盛花期、落花期的花序軸為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)研究表明，花序在不同發(fā)育時(shí)期對(duì)中國(guó)石蒜不定芽產(chǎn)生有顯著影響，盛花期產(chǎn)生的花序軸不定芽數(shù)量最多[9]。王麗等在對(duì)香雪蘭花序直接體細(xì)胞胚胎發(fā)生的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的體細(xì)胞胚都出現(xiàn)在花序軸切段的原形態(tài)學(xué)下端。上述研究結(jié)果與本試驗(yàn)一致[10]。光周期的不同對(duì)胚狀體形成有顯著影響，在每天光照14～16 h與黑暗8 h～10 h交替條件下體胚直接誘導(dǎo)效果最佳[11]。鄺哲師等研究發(fā)現(xiàn)，黑暗培養(yǎng)對(duì)香蕉體胚直接發(fā)生有促進(jìn)作用，黑暗條件抑制了外植體本身酚類(lèi)物質(zhì)的氧化，減少了醌類(lèi)物質(zhì)形成產(chǎn)生的毒害[7]。

范國(guó)強(qiáng)等研究表明，懸鈴木外植體在黑暗條件下培養(yǎng)3 d后，再放置在光照時(shí)間為16 h/d的條件下培養(yǎng)，不僅可以促進(jìn)懸鈴木體細(xì)胞胚胎的發(fā)生，而且提高了體胚誘導(dǎo)率[12]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

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