萬晴姣+李欲軻+姚東校+乙引+洪鯤

摘要：采用RT-PCR技術(shù)從感染馬鈴薯X病毒貴州分離物PVX-GZ的普通煙葉片中擴(kuò)增出該病毒的外殼蛋白基因CP。測序結(jié)果表明，該CP基因全長714 bp，編碼237個氨基酸殘基。構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a（+）-CP，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），在25 ℃條件下以0.6 mmol/L異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thivgalactopyranoside，簡稱IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白基因；SDS-PAGE分析表明，重組蛋白分子量約為45 ku；以該重組蛋白為抗原免疫新西蘭大白兔，制備的抗體效價達(dá)1 ∶12 800；間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunsorbent assay，簡稱ELISA）檢測顯示，該多抗能與PVX病葉汁發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，而與其他5種同屬或不同屬病毒葉汁無血清學(xué)交叉反應(yīng)。結(jié)果為病毒血清學(xué)檢測試劑盒的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯X病毒；外殼蛋白；原核表達(dá)；多克隆抗體；CP基因；RT-PCR技術(shù)；IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；ELISA檢測

中圖分類號： S435.32文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）23-0027-03

是馬鈴薯最常見的病毒之一，是馬鈴薯X病毒屬（Potexviruses）的典型成員，1931年由Smith在馬鈴薯上發(fā)現(xiàn)，目前在世界各地均有發(fā)現(xiàn)。PVX可侵染16科240余種植物，侵染茄科（Solanaceae）種類最多[1-3]。感染PVX病毒的馬鈴薯可能表現(xiàn)出的癥狀有萎縮、斑駁、葉子尺寸變小和花葉等，有時也會在塊莖上出現(xiàn)壞死斑，表現(xiàn)的癥狀及輕重和PVX株系及所侵染馬鈴薯的品種有關(guān)[4]。

PVX為（+）ssRNA線狀病毒，基因組長度約為6.4 kb，共有5個開放閱讀框架（open reading frame，簡稱ORF），近3′端的ORF編碼25 ku病毒外殼蛋白（簡稱CP）[1，5-6]。

馬鈴薯作為世界性重要的農(nóng)業(yè)資源和多種工業(yè)加工原料，受到世界各國的高度重視。馬鈴薯是貴州省僅次于水稻、玉米居第3位的糧食作物[7]。鄭世玲等對貴州省馬鈴薯種植區(qū)的部分樣品進(jìn)行病毒的血清學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)大部分樣品為2種或多種病毒共同侵染[8]。顏謙等對貴州省海拔500～2 500 m 之間馬鈴薯產(chǎn)區(qū)的調(diào)查結(jié)果顯示，PVX危害有逐年上升的趨勢[9]。病毒的侵染除直接引起馬鈴薯病毒病外，更重要的是會導(dǎo)致種質(zhì)退化，引起產(chǎn)量的急劇下降[9]。目前，通過脫毒技術(shù)去除PVX病毒是防治該病毒最為有效的手段，脫毒效果需要通過間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunsorbent assay，簡稱ELISA）等檢測方能確認(rèn)。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室已從貴州省感染PVX的馬鈴薯中分離出PVX-GZ，經(jīng)鑒定該分離株屬于PVX的X3株系[10]。本研究采用RT-PCR等技術(shù)克隆PVX-GZ CP基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，使其在大腸桿菌中大量表達(dá)，用獲得的重組蛋白免疫家兔，制備出高效、靈敏、特異的抗血清，為PVX血清學(xué)檢測試劑盒的研發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

植物總RNA提取試劑（RNAiso Plus）、一步RT-PCR試劑盒、BamHⅠ和HindⅢ限制酶、大腸桿菌DH5α菌株和pMD18-T克隆載體均購自寶生物工程（大連）有限公司；BL21（DE3）菌株和pET32a（+）載體、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，簡稱PVY）、馬鈴薯S病毒（potato virus S，簡稱PVS）、建蘭花葉病毒（cymbidium mosaic virus，簡稱CyMV）、齒蘭環(huán)斑病毒（odontoglossum ringspot virus，簡稱ORSV）和辣椒輕斑駁病毒（pepper mild mottle virus，簡稱PMMoV）由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存提供；PVX（普通煙）、PVY（昆諾藜）、PVS（昆諾藜）、CyMV（曼陀羅）、ORSV（莧色藜）、PMMoV（莧色藜）病葉取自筆者所在實(shí)驗(yàn)室防蟲溫室；堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G（簡稱IgG）及顯色底物堿性磷酸酯顯色試劑盒（BCIP/NBT）購自碧云天（Beyotime）生物技術(shù)研究所；ELISA顯色底物對-硝基苯磷酸二鈉（簡稱pNPP）購自索來寶（Solarbio）公司；清潔級3月齡新西蘭大白兔購自貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，并由其隔離飼養(yǎng)。其他常規(guī)分子生物學(xué)試劑購自北京天根（Tiangen）生化科技有限公司。

1.2PVX CP基因的克隆

根據(jù)GenBank中PVX CP基因全長序列設(shè)計1對特異性PCR引物（加下劃線部分分別為BamHⅠ、HindⅢ酶切位點(diǎn)）：上游引物5′-GCGGATCCATGTCAGCACCAGCTAGCAC-3′、下游引物5′-GCTAAGCTTTTATGGTGGTGGGAGAGTGAC-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。病葉總RNA提取按照RNAiso Plus試劑說明書步驟完成。PCR擴(kuò)增按照RT-PCR試劑盒（Prime ScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2，TaKaRa）說明書建議的反應(yīng)體系進(jìn)行。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化DH5α菌株，篩選陽性克隆并提取質(zhì)粒DNA送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3PVX CP基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建和重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

用BamHⅠ和Hind Ⅲ分別雙酶切重組載體pMD18T-CP和表達(dá)載體pET32a（+），回收目的片段并連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），菌液PCR和雙酶切鑒定陽性重組菌。將重組菌在不同溫度和不同濃度IPTG條件下誘導(dǎo)表達(dá)，優(yōu)化表達(dá)條件。收獲誘導(dǎo)表達(dá)菌體并用磷酸鹽緩沖液（簡稱PBS）重懸，超聲裂解菌體，離心取沉淀和上清液以10%SDS-PAGE對重組蛋白進(jìn)行可溶性分析。endprint

1.4PVX CP多克隆抗體的制備和效價測定

隔離觀察健康的新西蘭大白兔，耳靜脈采血作為陰性血清。誘導(dǎo)表達(dá)菌體用PBS重懸，超聲裂解菌體，離心取上清混合等體積福氏不完全佐劑（初次免疫用福氏完全佐劑）作為免疫抗原，按500 μg/只重組蛋白劑量在兔背部皮下多點(diǎn)注射。每7 d免疫1次，共5次。最后1次免疫7 d后，耳靜脈采血測定效價，心臟采血制備血清。將抗血清作倍比稀釋后采用間接ELISA方法[11]測定效價。

1.5多克隆抗體蛋白質(zhì)印跡（western blot）分析和特異性評價

通過電轉(zhuǎn)移將10%SDS-PAGE膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素（簡稱NC）膜上，以制備的多抗作為一抗，堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，BCIP/NBT顯色檢測表達(dá)的重組蛋白[12]。以筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存的PVX、PVY、PVS、CyMV、ORSV、PMMoV這6種病毒分別感染寄主植物，制備相應(yīng)的病葉汁包被酶標(biāo)板，以健康葉汁作為陰性對照，采用間接ELISA法[11]分析多抗的特異性。

2結(jié)果與分析

2.1PVX CP基因的RT-PCR擴(kuò)增和序列分析

RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可觀察到與PVX CP基因（714 bp）大小接近的擴(kuò)增條帶（圖1）。

PCR產(chǎn)物純化后克隆至pMD18-T載體中，測序結(jié)果表明，該基因序列全長714 bp，編碼237個氨基酸殘基（圖2）。

2.2重組表達(dá)載體的鑒定和PVX CP基因的原核表達(dá)

將重組表達(dá)載體pET32a（+）-CP進(jìn)行菌液PCR和酶切鑒定。PCR和酶切后電泳檢測得到與預(yù)測大小相符的目的條帶。測序結(jié)果表明，PVX CP基因已成功插入表達(dá)載體pET32a（+）中。重組表達(dá)載體pET32a-CP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）構(gòu)建重組菌BL-CP，以0.6 mmol/L IPTG在 25 ℃ 下誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)10%SDS-PAGE檢測，在45 ku處有1條明顯條帶，與經(jīng)EditSeq軟件估算的重組融合蛋白的分子量大小一致，誘導(dǎo)表達(dá)7 h重組蛋白表達(dá)量達(dá)到峰值（圖3）。菌體經(jīng)超聲破碎離心后，SDS-PAGE檢測顯示，重組蛋白主要以可溶的形式存在（圖4）。

2.3抗體的效價測定

以重組菌體裂解液為包被抗原，制備的倍比稀釋抗血清為一抗，堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，pNPP為底物，

用間接ELISA方法檢測抗體效價，免疫前兔血清為陰性對照。表1數(shù)據(jù)說明，ID-ELISA檢測當(dāng)抗體的稀釋度達(dá)到 1 ∶12 800 時，其P/N（陽性/陰性）仍大于2.0，表明該抗體的效價可達(dá)1 ∶12 800。

2.4Western blot檢測結(jié)果

以制備的PVX CP多克隆抗體對重組蛋白進(jìn)行免疫檢測。Western blot結(jié)果表明，所制備的抗血清能與誘導(dǎo)表達(dá)的重組CP蛋白發(fā)生較強(qiáng)的特異性反應(yīng)（圖5）。

2.5抗體的特異性評價

將多克隆抗體按1 ∶1 000稀釋，以健康普通煙葉汁作為陰性對照， 間接ELISA法檢測抗血清特異性， 包被抗原為感染各病毒的寄主植物病葉汁，樣品D405 nm大于陰性對照2倍判定為陽性，陰性對照值小于0.05則按0.05計。由表2可見，該抗血清僅與PVX感染的病葉汁發(fā)生較強(qiáng)的血清學(xué)反應(yīng)，而

與侵染馬鈴薯的其他常見病毒PVY或PVS病葉汁不發(fā)生免疫反應(yīng)，也不與同屬的CyMV及不同屬的其他2種病毒病葉汁發(fā)生血清學(xué)交叉反應(yīng)，表明制備的抗血清具有較強(qiáng)特異性。

3結(jié)論與討論

PVX的外殼蛋白除了包裝核酸外，也是病毒細(xì)胞間移動所不可或缺的，并在復(fù)制調(diào)節(jié)上起重要作用[13]。本研究克隆和原核表達(dá)了PVX的CP基因，同時制備出特異性多克隆抗體，為深入研究該蛋白在感病植物細(xì)胞中的作用特點(diǎn)、從分子水平探討該病毒的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，用重組CP蛋白免疫家兔獲得的抗血清具有較高的效價和較好的特異性，為下一步研制該病毒的血清學(xué)檢測試劑盒打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，并將在馬鈴薯脫毒生產(chǎn)及大田檢測等方面得到廣泛的推廣應(yīng)用。

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