姜志欣+林寧+石慧

[摘要] 目的 分析GJB2基因熱點突變在耳聾及耳聾高危人群中的突變譜和突變頻率。 方法 收集2014年11月～2017年3月江蘇地區(qū)耳聾患者59例及耳聾高危人群49例，應(yīng)用熒光PCR法對其進(jìn)行GJB2基因的4個熱點突變位點篩查，分析突變數(shù)據(jù)，通過直接測序法驗證其全部檢測結(jié)果。 結(jié)果 108例研究對象中，檢測出GJB2基因突變共84例，檢出率為77.78%。其中c.235del C、c.299-300delAT、c.176del16bp和c.512insAACG檢出率分別為62.96%（68/108）、17.59%（19/108）、13.89%（15/108）和0.93%（1/108）。耳聾患者中GJB2 c.235del C純合突變和GJB2雙等位基因突變發(fā)生率分別為30.51%（18/59）和28.81%（17/59），耳聾高危人群中未發(fā)現(xiàn)純合突變和雙等位基因突變。進(jìn)一步采用直接測序法驗證全部檢測結(jié)果，其結(jié)果與熒光PCR法一致。 結(jié)論 在本研究中c.235del C是最常見的熱點突變，GJB2 c.235del C純合突變是最為常見的分子致病因素，其次是GJB2雙等位基因突變。

[關(guān)鍵詞] GJB2基因；熒光PCR；突變分析

[中圖分類號] R764.43 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）12（c）-0033-04

[Abstract] Objective To analyze the mutation frequency and spectrum of GJB2 gene hotspot mutations in the deafness patients and the high risk population. Methods There were 59 cases of deafness patients and 49 cases of high risk population in Jiangsu who were collected from November 2014 to March 2017. Four common mutations of GJB2 gene were detected by fluorescencence PCR technique. The mutation data were analyzed and summarized， and all results were further validated by Sanger sequencing. Results Allelic variants were observed in 84 of the 108 subjects with a positive rate of 77.78% （84/108）. The incidences of c.235del C， c.299-300delAT， c.176del16bp and c.512insAACG were 62.96% （68/108）， 17.59% （19/108）， 12.96% （14/108） and 0.93% （1/108） respectively. The carrying rates of homozygous genes in GJB2 c.235del C and biallelic mutations in GJB2 in the deafness patients were 30.51% （18/59） and 28.81% （17/59）. No homozygous genes and biallelic mutations were found in the high risk population. All results further validated by Sanger sequencing showed consistent with those by fluorescence PCR technique. Conclusion In this study， c.235delC mutation is the hotspot of GJB2 gene mutation. GJB2 c.235del C homozygous genes are the most common molecular risk factors followed by GJB2 biallelic mutations.

[Key words] GJB2 gene； Fluorescence PCR； Mutation analysis

先天性耳聾是人類最常見的出生缺陷之一，發(fā)病率為1‰～3‰。我國作為人口大國，聽力言語殘者多達(dá)2780萬，占?xì)埣踩丝倲?shù)的33.58%，其中0～6歲聽障兒童達(dá)13.7萬，且每年新生聾兒2.3萬[1]。50%以上的先天性耳聾可能與遺傳因素相關(guān)[2]，已發(fā)現(xiàn)40多個與耳聾相關(guān)的基因，100多個基因位點[3]。其中縫隙連接蛋白beta2（gap junction protein beta2，GJB2）基因突變被認(rèn)為是引起遺傳性耳聾的常見原因之一[4-7]。本研究應(yīng)用熒光PCR法檢測江蘇部分地區(qū)耳聾及耳聾高危人群的GJB2基因，分析其突變譜和突變頻率，為耳聾及耳聾高危人群的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供理論基礎(chǔ)，探討采用熒光PCR法對耳聾高危人群檢測的臨床意義。

1 對象與方法

1.1 對象

收集2014年11月～2017年3月來自于江蘇地區(qū)的研究對象108例，均為漢族，年齡1～49歲。其中耳聾患者59例，均為感音神經(jīng)性耳聾，在醫(yī)生指導(dǎo)下填寫“耳聾基因篩查記錄冊”，獲取相關(guān)信息，包括一般情況、發(fā)病年齡、個人史及家族史；耳聾高危人群49例，為上述耳聾患者二代以內(nèi)近親屬或配偶，聽力均正常。所有研究對象均簽署知情同意書，項目研究通過江蘇省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究所倫理醫(yī)學(xué)委員會評審。endprint

1.2 方法

1.2.1 主要儀器與試劑 TIANamp Blood DNA Kit（天根生物技術(shù)公司），GJB2基因檢測試劑盒（熒光PCR法）（濟(jì)南英盛生物技術(shù)有限公司），ABI 9700 PCR擴(kuò)增儀。

1.2.2 基因提取 采集受檢者3～5 mL外周靜脈血（空腹），血液放入EDTA抗凝劑的真空采血管，統(tǒng)一編號。應(yīng)用TIANamp Blood DNA Kit分離全基因組DNA，按試劑盒說明書操作，分光光度法檢測DNA濃度和純度，DNA濃度在1～300 ng/μL范圍內(nèi)，純度（A260/A280）在1.7～1.9為合格。

1.2.3 基因檢測 采用GJB2基因檢測試劑盒探針特異性PCR技術(shù)，按照GJB2基因的4個常見突變位點（235delC、299-300delAT、176del16bp、512insAACG）的突變序列來設(shè)計高度特異的雙標(biāo)記熒光TaqMan探針，通過在ABI 9700 PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，與模板DNA結(jié)合，收集熒光信號，累積曲線，實時讀取定性結(jié)果，判讀是否存在相關(guān)基因位點的突變。PCR反應(yīng)條件見圖1。陰陽性質(zhì)控擴(kuò)增判讀見圖2、3，可依據(jù)此位點的陰陽性質(zhì)控擴(kuò)增圖判讀樣本該檢測位點的結(jié)果。全部結(jié)果進(jìn)一步采用直接測序法進(jìn)行驗證。

1.2.4 DNA測序 GJB2基因引物設(shè)計，PCR特異片段擴(kuò)增體系、溫度、時間等條件的設(shè)置參照文獻(xiàn)[8]。PCR產(chǎn)物行2%瓊脂凝膠電泳，選取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化，在ABI3700自動測序儀上行直接測序（正反向測序），通過DNAstar軟件的SeqMan分析測序結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 GJB2基因突變情況

108例研究對象中，共檢測出GJB2基因突變84例，檢出率為77.78%。其中單等位基因突變67例、雙等位基因突變17例；純合突變20例、雜合突變64例；四個常見的位點c.235del C、c.299-300delAT、c.176del16bp和c.512insAACG突變檢出率分別為62.96%（68/108）、17.59%（19/108）、13.89%（15/108）和0.93%（1/108）。

2.2 不同研究對象中GJB2基因突變位點、突變方式及分布情況

耳聾患者中發(fā)現(xiàn)了20例GJB2純合突變和17例雙等位基因突變。其中c.235del C純合突變18例，c.299-300delAT純合突變1例，c.176del16bp純合突變1例。GJB2 c.235del C純合突變和GJB2雙等位基因突變發(fā)生率分別為30.51%（18/59）和28.81%（17/59）。耳聾高危人群中發(fā)現(xiàn)了36例GJB2突變基因攜帶者，攜帶率為72%（36/49），未發(fā)現(xiàn)純合突變和雙等位基因突變，見表1。采用直接測序法檢測全部研究對象的檢測樣本，結(jié)果與熒光PCR完全一致。

3 討論

在我國聽力殘疾是最常見的出生缺陷之一，是目前提高人口素質(zhì)、改善生活質(zhì)量所面臨的嚴(yán)峻公共衛(wèi)生問題。隨著對耳聾分子病因?qū)W的研究，遺傳因素在耳聾的發(fā)病中得到越來越多的重視。遺傳性耳聾患者的60%～70%為非綜合征性耳聾（nonsyndromic hearing impairment，NSHI），又有80%的NSHI屬于常染色體隱性遺傳[9]。研究證實GJB2基因突變引起的NSHI耳聾較為常見[10-11]，GJB2基因編碼區(qū)為678 bp，主要由兩個外顯子組成，編碼區(qū)主要存在在外顯子2上[12]，其基因編碼產(chǎn)物為縫隙連接蛋白（Connexin-26，Cx-26），Cx-26分布于耳蝸的血管紋、基底細(xì)胞、螺旋緣凸、神經(jīng)感覺上皮及耳蝸傳導(dǎo)纖維等處，參與細(xì)胞間信號介導(dǎo)和離子傳遞，突變的GJB2基因可能導(dǎo)致Cx-26異常，進(jìn)而影響細(xì)胞間隙的連接功能，引起內(nèi)耳鉀離子回收障礙而致耳聾[13-16]。

GJB2呈常染色體隱性遺傳，臨床相關(guān)癥狀為重度以上感音神經(jīng)性耳聾，往往隔代遺傳，男女均可罹患，發(fā)現(xiàn)后可通過植入人工耳蝸干預(yù)，避免因聾致啞。在本研究人群中，c.235delC發(fā)生頻率最高，符合235delC為國內(nèi)最常見的基因突變的結(jié)論[17-18]，GJB2 235delC純合突變是最為常見的分子致病因素，與以往研究結(jié)果[19-20]一致。另本研究非聾高危人群中共發(fā)現(xiàn)了36例GJB2突變基因攜帶者，攜帶率高達(dá)72%（36/49），明顯高于柳紅杰[18]、韓明昱[21]等的報道，分析其原因可能是目標(biāo)人群不同，本研究目標(biāo)人群主要來源于聾人及其直系親屬、配偶，柳紅杰[18]、韓明昱[21]等則為正常聽力孕婦。

聾啞人因自身情況特殊，在現(xiàn)實社會常以“聾-聾”婚配形式存在，聾人夫妻具有相同基因突變位點的概率大大增加，后代耳聾風(fēng)險也相應(yīng)增加。因此依據(jù)遺傳模式對聾人或突變基因攜帶者等高危人群進(jìn)行檢出率較高的GJB2基因的突變檢測，進(jìn)一步的進(jìn)行相關(guān)婚育指導(dǎo)和后代遺傳性耳聾風(fēng)險的評估很有必要。據(jù)此，廣泛開展耳聾基因篩查與耳聾產(chǎn)前診斷，實現(xiàn)遺傳性耳聾的二級預(yù)防，在婚檢或生育前進(jìn)行耳聾基因篩查，可避免雙方均為同一耳聾突變基因攜帶者的夫婦生育聾兒。此外，通過孕期母親或新生兒的耳聾基因篩查，可及早地發(fā)現(xiàn)藥物性耳聾敏感個體、遲發(fā)性遺傳性耳聾個體，通過早期干預(yù)，可有效預(yù)防耳聾發(fā)生。

人類基因組的復(fù)雜性及耳聾基因的高度遺傳異質(zhì)性加大了耳聾基因檢測的難度，給遺傳性耳聾的診斷及預(yù)防帶來了一定的困難?；蛑苯訙y序技術(shù)是目前應(yīng)用最多的遺傳性耳聾檢測方法，也是迄今為止分子診斷學(xué)中基因突變檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，其具有技術(shù)平臺標(biāo)準(zhǔn)化、結(jié)果直觀、準(zhǔn)確性極高等優(yōu)點，可以對任意基因進(jìn)行全序列分析，但因其費時、費力且成本較高，這種方法尚不具備應(yīng)用于大規(guī)模人群篩查的條件。耳聾高發(fā)致病基因及突變熱點存在種族和人群差異，國內(nèi)開展的大規(guī)模耳聾分子流行病學(xué)研究表明，中國絕大部分遺傳性耳聾只與少數(shù)幾個基因有關(guān)，如GJB2、SLC26A4、12SrRNA及GJB3等[22-23]，為熱點基因篩查方法應(yīng)用于大規(guī)模人群篩查提供了理論依據(jù)。本研究采用熒光PCR法檢測耳聾基因具有檢測基因位點選擇靈活、耗時短，高通量、低成本、操作簡便快捷、結(jié)果判讀簡單等優(yōu)點，能夠滿足對中國人群耳聾基因熱點突變篩查的要求。endprint

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（收稿日期：2017-10-23 本文編輯：任 念）endprint