侯亮+馮海利

[摘要] 目的 探討腦膠質(zhì)瘤組織中P-糖蛋白（P-gp）、多藥抗藥性相關(guān)蛋白（MRP）、乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白（BCRP）的表達(dá)及臨床意義。 方法 選擇2007年7月～2016年7月于武安市第一人民醫(yī)院手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本56例作為觀察組，同期腦外傷的正常腦組織10例作為對照組。應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測兩組標(biāo)本中的P-gp、MRP、BCRP表達(dá)情況，并分析其與腦膠質(zhì)瘤患者的臨床病理特征的關(guān)系。 結(jié)果 觀察組P-gp、MRP、BCRP陽性表達(dá)率分別為42.86%（24/56）、76.79%（43/56）、46.43%（26/56），均明顯低于對照組的0.00%（0/10）、10.00%（1/10）、0.00%（0/10）（P < 0.01）。腦膠質(zhì)瘤組織P-gp、MRP、BCRP陽性表達(dá)率與腫瘤病理分期、組織學(xué)分級有關(guān)，病理分期越高，P-gp、MRP、BCRP陽性表達(dá)率越高；組織學(xué)分級越低，P-gp、MRP、BCRP陽性表達(dá)率越高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。Spearman等級相關(guān)分析顯示，腦膠質(zhì)瘤組織P-gp陽性表達(dá)率與MRP、BCRP陽性表達(dá)率呈正相關(guān)（Rs = 0.612、0.537，P < 0.05）。 結(jié)論 腦膠質(zhì)瘤組織中P-gp、MRP、BCRP均呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤病理分期、組織學(xué)分級有關(guān)，且三者表達(dá)呈正相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 腦膠質(zhì)瘤；P-糖蛋白；多藥抗藥性相關(guān)蛋白；乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白；免疫組織化學(xué)法

[中圖分類號] R739.41 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）12（b）-0012-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significance of P- glycoprotein （P-gp）， multidrug resistance associated protein （MRP） and multidrug resistance associated protein （BCRP） in brain gliomas. Methods Fifty-six cases of brain glioma resected in the First People's Hospital of Wuan from July 2007 to July 2016 were selected as the observation group， and 10 normal brain tissues of brain trauma in the same period were selected as control group. The expressions of P-gp， MRP and BCRP in specimens of two groups were detected by immunohistochemistry （SP）， and the relationship between the expression and clinical pathological features of glioma was analyzed. Results The P-gp， MRP， BCRP positive expression rates of the observation group was 42.86% （24/56）， 76.79% （43/56）， 46.43% （26/56）， respectively， was significantly lower than the control group of 0% （0/10）， 10% （1/10）， 0% （0/10） （P < 0.01）. The positive rates of P-gp， MRP and BCRP in glioma was related to the pathological stage and histological grade of glioma， the higher the pathological stage， the higher the positive expression rate of P-gp， MRP and BCRP. The lower the histological grade， the higher the positive expression rates of P-gp， MRP and BCRP， and the differences were statistically significant （P < 0.01）. Spearman rank correlation analysis showed that the positive rate of P-gp expression in glioma tissues was positively correlated with the positive rates of MRP and BCRP （Rs = 0.612， 0.537， P < 0.05）. Conclusion The expressions of P-gp， MRP and BCRP are highly expressed in gliomas， and the expression level is related to the pathological stage and histological grade， and the three expressions are positively correlated.

[Key words] Brain glioma； P-glycoprotein； Multidrug resistance associated protein； Breast cancer resistance related protein； Immunohistochemistryendprint

腦膠質(zhì)瘤是臨床上最為常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)腫瘤之一，約占顱內(nèi)腫瘤的50%[1]。該病具有較高的發(fā)病率，且近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢[2]。目前，臨床上對于腦膠質(zhì)瘤主要是采用手術(shù)治療，但由于腦膠質(zhì)瘤惡性程度較高，多呈浸潤性生長，腫瘤邊界不明顯，僅通過手術(shù)治療難以達(dá)到完全切除的效果，術(shù)后常需要輔助化療、免疫治療等[3]。近年來，隨著腫瘤多藥耐藥性的發(fā)生，化療藥物敏感性逐漸下降，導(dǎo)致患者預(yù)后不良[4]。P-糖蛋白（P-gp）是多藥耐藥基因編碼的一種單鏈跨膜糖蛋白，與化療耐藥密切相關(guān)[5]。而多藥抗藥性相關(guān)蛋白（multidrug resistant proteins，MRP）和乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）是目前已知的與化療耐藥相關(guān)的重要蛋白，不僅影響腦膠質(zhì)瘤化療效果，也可能與腫瘤惡性程度有關(guān)[6]。鑒于此，本研究探討腦膠質(zhì)瘤組織中P-gp、MRP、BCRP的表達(dá)及臨床意義，目的在于進(jìn)一步分析上述指標(biāo)與膠質(zhì)瘤的病理級別關(guān)系，從而為腦膠質(zhì)瘤的化療提供新的靶點與思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2007年7月～2016年7月武安市第一人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）手術(shù)切除并經(jīng)病理診斷確診的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本56例，其中男32例，女24例；年齡20～72歲，平均（41.2±6.2）歲；根據(jù)Ann Arbor系統(tǒng)對所有患者進(jìn)行臨床病理分期：Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期26例；組織學(xué)分級：低分化19例，中、高分化37例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①患者臨床資料完整；②本次就診為腦部疾病初次就診，術(shù)前未經(jīng)任何放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①同時患有其他系統(tǒng)腫瘤患者；②腎、肝功能異?；颊撸虎埏B內(nèi)退行性病變患者；④既往有神經(jīng)、精神系統(tǒng)疾病病史。同時選取同期因外傷切取的正常腦組織標(biāo)本10例作為對照組，其中男6例，女4例；年齡18～70歲，平均（36.75±5.35）歲。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），有可比性?；颊呔炇鹆酥橥鈺狙芯拷?jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

P-gp小鼠抗人單克隆抗體，MRP小鼠抗人單克隆抗體，液體DAB酶底物顯色試劑盒，4%中性甲醛溶液以及SP-9002免疫組化試劑盒。上述試劑購自廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司。PBS緩沖液購自北京武警總醫(yī)院病理實驗室。

1.3 免疫組織化學(xué)SP法

所有標(biāo)本均經(jīng)5%福爾馬林固定、液體石蠟包埋，冷卻，制成4 μm厚度連續(xù)切片。并應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測兩組標(biāo)本中的P-gp、MRP、BCRP表達(dá)情況，具體方式如下：梯度酒精脫水，PBS緩沖液沖洗，高溫高壓抗原修復(fù)，PBS緩沖液沖洗，加入生物學(xué)一抗過夜，山羊血清封閉，加入生物學(xué)二抗，DAB顯色，梯度酒精水化，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。取已知P-gp、MRP陽性切片為陽性對照，以PBS替代一抗為陰性對照。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

腦組織細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜內(nèi)存在棕黃色顆粒記為P-gp、MRP陽性，隨機選取5個高倍鏡視野，視野中陽性細(xì)胞數(shù)占比<10%記為陰性，陽性細(xì)胞數(shù)占比≥10%記為陽性[7]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，并應(yīng)用Speraman相關(guān)分析相關(guān)性，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組P-gp、MRP、BCRP表達(dá)情況比較

觀察組P-gp、MRP、BCRP陽性表達(dá)率均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見表1。

2.2 腦膠質(zhì)瘤組織中P-gp陽性表達(dá)率與患者病理特征關(guān)系分析

腦膠質(zhì)瘤組織中P-gp陽性表達(dá)率與患者的性別、年齡無關(guān)（P > 0.05）；病理分期Ⅲ～Ⅳ期、組織學(xué)分級為低分化腦膠質(zhì)瘤患者的P-gp陽性表達(dá)率均明顯高于病理分期為Ⅰ～Ⅱ期、組織學(xué)分級為中、高分化者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見表2。

2.3 腦膠質(zhì)瘤組織中MRP陽性表達(dá)率與患者病理特征關(guān)系分析

腦膠質(zhì)瘤組織中MRP陽性表達(dá)率與患者的性別、年齡無關(guān)（P > 0.05）；病理分期為Ⅲ～Ⅳ期、組織學(xué)分級為低分化腦膠質(zhì)瘤患者的MRP陽性表達(dá)率均明顯高于病理分期為Ⅰ～Ⅱ期、組織學(xué)分級為中、高分化患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見表3。

2.4 腦膠質(zhì)瘤組織中BCRP陽性表達(dá)率與患者病理特征關(guān)系分析

腦膠質(zhì)瘤組織中BCRP陽性表達(dá)率與患者的性別、年齡無關(guān)（P > 0.05）；病理分期為Ⅲ～Ⅳ期、組織學(xué)分級為低分化腦膠質(zhì)瘤患者的BCRP陽性表達(dá)率，均明顯高于病理分期為Ⅰ～Ⅱ期、組織學(xué)分級為中、高分化患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見表4。

2.5 腦膠質(zhì)瘤組織中P-gp、MRP、BCRP表達(dá)的相關(guān)性

Spearman等級相關(guān)分析顯示，腦膠質(zhì)瘤組織P-gp陽性表達(dá)率與MRP、BCRP陽性表達(dá)率呈正相關(guān)（Rs = 0.612、0.537，P < 0.05）。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病率在所有顱內(nèi)腫瘤中位居首位，臨床主要采用手術(shù)治療[8]。但由于腦膠質(zhì)瘤惡性程度較高，僅通過手術(shù)治療難以達(dá)到根治效果，患者術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，有研究報道顯示，腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后平均生存期為1年[9]。而術(shù)后化療在腦膠質(zhì)瘤的綜合治療過程中具有積極作用。近年來，隨著化療的廣泛應(yīng)用，腫瘤多藥耐藥發(fā)生率逐漸升高，化療敏感性降低，成為患者預(yù)后不良的重要原因。因此，如何有效提高化療效果是目前臨床上備受關(guān)注的熱點。分子生物學(xué)研究顯示[10-11]，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中部分耐藥基因及其產(chǎn)物的表達(dá)水平是導(dǎo)致化療耐藥的主要機制。其中P-gp是多藥耐藥基因編碼的跨膜糖蛋白，可以通過外轉(zhuǎn)運機制將多種化療藥物泵出細(xì)胞外，降低化療敏感度[12]。而MRP則可以通過與化療藥物中的葡萄糖醛酸甙形成共軛化合物，降低化療敏感度[13]。BCRP屬于ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白，則可以介導(dǎo)20多種化療藥物的耐藥[13]。以上三種分子可能影響腦膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為。endprint

本研究通過對腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本和正常腦組織比較發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本P-gp、MRP、BCRP陽性表達(dá)率均明顯高于正常腦組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。這與Jeibmann等[14]的研究報道相一致，表明了腦膠質(zhì)瘤組織中P-gp、MRP、BCRP均呈高表達(dá)。此外，腦膠質(zhì)瘤患者病理分期為Ⅲ～Ⅳ期、組織學(xué)分級為低分化患者的P-gp、MRP、BCRP陽性表達(dá)率均明顯高于病理分期為Ⅰ～Ⅱ期、組織學(xué)分級為中、高分化患者。證實了腦膠質(zhì)瘤組織P-gp、MRP、BCRP陽性表達(dá)率與腫瘤病理分期、組織學(xué)分級有關(guān)。目前有研究報道顯示[15]，P-gp能夠泵出秋水仙堿、依托泊苷、長春新堿等藥物；其可通過外排轉(zhuǎn)運機制將通過細(xì)胞膜的親脂性藥物泵出細(xì)胞外，從而降低化療藥物的作用效果。MRP不僅屬于能量泵之一，同時亦是谷胱甘肽偶合泵之一，可介導(dǎo)化療藥物中的葡萄糖醛酸甙共軛物、硫酸鹽共軛物以及谷胱甘肽硫共軛物排出細(xì)胞，進(jìn)一步引發(fā)耐藥的產(chǎn)生[16-17]。同時，MRP主要定位于細(xì)胞膜，參與了細(xì)胞質(zhì)內(nèi)囊泡的運輸，進(jìn)一步導(dǎo)致藥物亞細(xì)胞分布的改變，從而促使化療藥物不能與其靶點結(jié)合，最終導(dǎo)致了耐藥的產(chǎn)生[18]。BCRP屬于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白超家族成員之一，作為細(xì)胞膜上的藥物排出泵，其能排出20多種細(xì)胞毒性藥物，從而對藥物作用產(chǎn)生極大的影響[19-20]。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，P-gp、MRP、BCRP可能在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。同時，Spearman等級相關(guān)分析顯示，腦膠質(zhì)瘤組織P-gp陽性表達(dá)率與MRP、BCRP陽性表達(dá)率呈正相關(guān)。筆者推測P-gp、MRP、BCRP可能通過相互影響，從而促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和耐藥，其具體機制有待于進(jìn)一步研究證實。本結(jié)果也提示臨床上可以通過對P-gp、MRP、BCRP干預(yù)，降低化療的耐藥性，為人腦膠質(zhì)瘤的化療提供新的方法，也為抗腫瘤藥物的研制提供了新思路。

綜上所述，腦膠質(zhì)瘤組織中P-gp、MRP、BCRP均呈高表達(dá)，臨床上可通過對上述三項指標(biāo)表達(dá)情況進(jìn)行檢測，從而為腦膠質(zhì)瘤患者的診斷、治療以及預(yù)后評估提供參考依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 張治華，范新義，趙梓彤，等.靶向干擾DNA-PKcs表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性表型及增敏替莫唑胺療效的分析[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2017，97（31）：2463-2467.

[2] 劉道佳，唐明燈，林端瑜，等.18F-FDG與18F-FLT PET/CT診斷腦膠質(zhì)瘤綜合治療后復(fù)發(fā)的對比研究[J].中華核醫(yī)學(xué)與分子影像雜志，2017，37（4）：198-201.

[3] 李鵬起，李秉琴，閆志豐，等.人巨細(xì)胞病毒蛋白pp65在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志，2017，16（3）：202-206.

[4] 黨帥，劉海玉，李東峰，等.微小RNA-22靶向調(diào)控異黏蛋白抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡[J].中華實驗外科雜志，2017，34（6）：1065.

[5] Aras Y，Erguven M，Aktas E，et al. Antagonist activity of the antipsychotic drug lithium chloride and the antileukemic drug imatinib mesylate during glioblastoma treatment in vitro [J]. Neurol Res，2016，38（9）：766-774.

[6] 成志勇，李琳，王亞麗，等.PTEN基因逆轉(zhuǎn)白血病多因素多藥耐藥機制探討[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2013，34（2）：142-147.

[7] Parent ME，Turner MC，Lavoué J，et al. Lifetime occupational exposure to metals and welding fumes，and risk of glioma：a 7-country population-based case-control study [J]. Environ Health，2017，16（1）：90-90.

[8] 胡婷，陳梅香，翁澤平，等.miR-21通過下調(diào)PTEN增強人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對卡莫司汀耐藥[J].中國病理生理雜志，2012，28（8）：1345-1351.

[9] 何國棟，薛兆亮，牛煥江，等.腦膠質(zhì)瘤中胞質(zhì)多聚腺苷酸化元件結(jié)合蛋白4的表達(dá)情況及其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的影響[J].中華全科醫(yī)學(xué)，2017，15（7）：1133-1136.

[10] 趙寶帥，張文超，徐占義，等.腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后肺部感染基質(zhì)金屬蛋白酶及胰島素樣生長因子相關(guān)指標(biāo)的變化[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2016，26（17）：3993-3995.

[11] 王新軍，楊如意，單嶠，等.人腦膠質(zhì)瘤組織HMGB1表達(dá)與膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇關(guān)系的探討[J].中華腫瘤防治雜志，2015，22（15）：1180-1183.

[12] 李瑋，譚建，王澎，等.hTERT和GFAP雙啟動子條件復(fù)制腺病毒介導(dǎo)放射性碘治療腦膠質(zhì)瘤的實驗研究[J].中華放射醫(yī)學(xué)與防護雜志，2014，34（1）：3-7.

[13] Lin F，de Gooijer MC，Hanekamp D，et al. PI3K-mTOR Pathway Inhibition Exhibits Efficacy Against High-grade Glioma in Clinically Relevant Mouse Models [J]. Clin Cancer Res，2017，23（5）：1286-1298.

[14] Jeibmann A，Halama K，Witte HT，et al. Involvement of CD9 and PDGFR in migration is evolutionarily conserved from Drosophila glia to human glioma [J]. J Neurooncol，2015，124（3）：373-383.

[15] 李劍，王建禎.腦膠質(zhì)瘤組織中MRP、MGMT蛋白、P-gp的表達(dá)觀察[J].山東醫(yī)藥，2015，55（47）：62-63.

[16] 霍海波.MGMT、TopoⅡα、P-gp在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)變化及意義[J].中國老年學(xué)雜志，2014，1（12）：3303-3304.

[17] 黃從剛，段發(fā)亮，陳謙學(xué)，等.X線照射后耐替莫唑胺U251細(xì)胞株中多藥耐藥基因MDR1及P-gp蛋白的表達(dá)[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2016，15（1）：60-64.

[18] Zhang R，Saito R，Shibahara I，et al. Temozolomide reverses doxorubicin resistance by inhibiting P-glycoprotein in malignant glioma cells [J]. J Neurooncol，2016，126（2）：235-242.

[19] 敬宏，鄭艾，牛曉宇，等.膜相關(guān)蛋白Numb在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及其與耐藥相關(guān)蛋白P糖蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白1的關(guān)系[J].中華婦幼臨床醫(yī)學(xué)雜志：電子版，2015，（3）：323-328.

[20] Verebova V，Belej D，Joniova J，et al. Deeper insights into the drug defense of glioma cells against hydrophobic molecules [J]. Int J Pharm，2016，503（1-2）：56-67.

（收稿日期：2017-10-19 本文編輯：任 念）endprint