賀棟才,李星廣,郭蔚華,*,林艷,楊鵬飛,劉晨茜
1. 四川省成都市市政工程設(shè)計(jì)研究院,成都 610023 2. 重慶大學(xué)城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院,重慶 400045
化學(xué)污染物對(duì)自然水體的污染已成為全球性的環(huán)境問題[1]。檢測(cè)各污染物的環(huán)境濃度水平、評(píng)價(jià)其毒性和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)一直是科學(xué)界和大眾關(guān)注的焦點(diǎn)[2]。在實(shí)際水環(huán)境中,往往有多種化學(xué)污染物同時(shí)存在,生物體通常暴露于混合的污染物中,它們對(duì)機(jī)體同時(shí)作用產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)(聯(lián)合作用)與任何一種化學(xué)污染物分別單獨(dú)作用所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)完全不同[3],因此,分析化學(xué)污染物之間的聯(lián)合作用是必要的。
微藻是水體中食物鏈的初級(jí)生產(chǎn)者,個(gè)體小,多為單細(xì)胞,對(duì)水環(huán)境污染敏感,可作為受試材料分析化學(xué)污染物間的聯(lián)合作用對(duì)自然水體的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)對(duì)化學(xué)污染物的脅迫作用極為敏感[4],其中滇池銅綠微囊藻生長(zhǎng)快[5-6]、飽和密度高,是測(cè)試分析化學(xué)污染物急性毒性和聯(lián)合作用的理想受試生物材料。藻類光合作用的電子傳遞鏈被抑制時(shí),藻類天線色素吸收的光能會(huì)產(chǎn)生剩余激發(fā)能[7],剩余激發(fā)能將以紅外輻射方式向藻細(xì)胞外擴(kuò)散。此外,許多化學(xué)污染物可使酶蛋白變性[8]影響藻的光合磷酸化、氧化磷酸化的能量代謝[9]。因此,化學(xué)污染物作用光合電子傳遞鏈和呼吸電子傳遞鏈所產(chǎn)生的熱輻射疊加后更易被儀器測(cè)試。有研究報(bào)道,Cd2+[10-11],Hg2+、Pb2+、Cu2+、Zn2+[12],樂果[13],莠去津[14],敵草隆、百草枯、阿特拉津[15]等對(duì)藻光合電子傳遞有抑制作用,紅霉素、環(huán)丙沙星、磺胺甲噁唑等抗生素[16],甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑[17],硝磺草酮[18],Ni、Zn、Al[9]等對(duì)藻光合磷酸化、氧化磷酸化有影響。藻類暴露于重金屬、農(nóng)藥、有機(jī)化學(xué)藥品、抗生素等有毒物質(zhì)時(shí),能產(chǎn)生強(qiáng)于其他微生物的更強(qiáng)的能量變化,可以用紅外測(cè)溫儀檢測(cè)到藻類的紅外輻射變化[19-22]。
藻紅外測(cè)試法和發(fā)光細(xì)菌法屬急性毒性微生物測(cè)試法,具有靈敏、快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)[23-29]。相比較而言,作為受試生物材料的藻類分布廣泛、藻種豐富、藻源充足,藻種的采取、純化、擴(kuò)大、培養(yǎng)等容易,藻種獲取成本低,測(cè)試用藻有保障,同時(shí),紅外測(cè)溫儀價(jià)格遠(yuǎn)低于發(fā)光細(xì)菌法所用的檢測(cè)儀,因而藻紅外技術(shù)更能滿足一般科研院所、科研團(tuán)隊(duì)和基層部門對(duì)技術(shù)的需求。
建立聯(lián)合作用藻紅外測(cè)試技術(shù)極為復(fù)雜,要考慮測(cè)試條件、測(cè)試藻種、藻溫測(cè)試方法、藻響應(yīng)藥品的評(píng)價(jià)方法、聯(lián)合作用評(píng)價(jià)方法[30]、聯(lián)合作用偏差f值的修正、藥液配制的標(biāo)準(zhǔn)、數(shù)據(jù)處理軟件等技術(shù)環(huán)節(jié)。在聯(lián)合作用測(cè)試[31-32]中不斷發(fā)現(xiàn)問題,為保證與控制測(cè)試結(jié)果的質(zhì)量,已完善了測(cè)試條件,改進(jìn)了藻溫的測(cè)試方法[33],修正了f值,確立了藥液配制的參照濃度分析方法等。二元聯(lián)合作用測(cè)試是多元聯(lián)合作用分析的基礎(chǔ),所建立的聯(lián)合作用藻紅外測(cè)試方法能否測(cè)試分析聯(lián)合作用、效果如何等問題仍需要實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)?;瘜W(xué)污染物的種類繁多,實(shí)驗(yàn)以種類數(shù)相對(duì)穩(wěn)定的重金屬作為測(cè)試藥品,進(jìn)行重金屬二元聯(lián)合作用藻紅外測(cè)試方法的驗(yàn)證研究。
本文將通過藥品的參照濃度分析確定測(cè)試藥液的配制濃度,進(jìn)行重金屬二元聯(lián)合作用測(cè)試,分析測(cè)試結(jié)果的多樣性、再現(xiàn)性、重現(xiàn)性,檢驗(yàn)測(cè)試效果,確定二元聯(lián)合作用藻紅外測(cè)試方法的可行性。
實(shí)驗(yàn)用藻為滇池銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosain Dianchi Lake in China),藻種及其培養(yǎng)基配方由中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所提供。測(cè)試藥品為CuSO4·5H2O、FeCl3·6H2O、MnSO4·H2O、AlCl3·6H2O、CrCl3·6H2O、HgSO4、Cd(NO3)3·H2O、Pb(NO3)2、ZnCl2,為國(guó)產(chǎn)分析純,藥液濃度為重金屬濃度(g·L-1),藥液現(xiàn)測(cè)現(xiàn)配。儀器設(shè)備包括ST60便攜式紅外測(cè)溫儀(靈敏度0.1 ℃),購(gòu)自福祿克測(cè)試儀器(上海)公司重慶分公司;HETTICH-EBA離心機(jī),購(gòu)自球興科儀國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司;LRH-250A生化培養(yǎng)箱(靈敏度±0.2 ℃),購(gòu)自韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司;MOTICBA200數(shù)碼顯微鏡,購(gòu)自上海中恒儀器有限公司;DR/4000U分光光度計(jì),購(gòu)自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。測(cè)試杯為直徑4 cm、高3 cm、厚0.1~0.2 cm的透明絕熱塑料容器。
測(cè)試藻溫處理與聯(lián)合作用分析可由軟件完成或人工完成。所用軟件有:①AITAS (Algae Infrared Toxican Analysis Software)藻紅外急性毒性分析軟件,用于分析藻對(duì)藥品濃度或樣品的響應(yīng);②AITHCAS (Algae Infrared Time and Half Concentration Analysis Software)藻紅外倍半濃度分析軟件,用于分析同藥倍半關(guān)系濃度;③AICEAS (Algae Infrared Combined Effect Analysis Software)藻紅外聯(lián)合作用分析軟件,用于分析藥品間的聯(lián)合作用類型。上述軟件AITAS、AITHCAS、AICEAS由郭蔚華、祁小明等開發(fā)。
為了提高藻對(duì)藥液響應(yīng)的評(píng)價(jià)效率,將原來的藻溫測(cè)試10遍改為9遍,因此在1.3.3中指標(biāo)③的藻響應(yīng)率由原來的≥60%改為≥55%。
藻溫測(cè)試在室內(nèi)條件下進(jìn)行,采用散射日光或人工光源采光。實(shí)驗(yàn)的藻液用量為5 mL·杯-1,藻密度≥3.16×109個(gè)·L-1;測(cè)試杯加藻液前,藻液充分搖均;當(dāng)培養(yǎng)時(shí)藻增長(zhǎng)率≤0時(shí),藻液不再用于實(shí)驗(yàn);測(cè)試一種藥物的聯(lián)合作用時(shí),使用同一批培養(yǎng)的藻液。滴加藥液前,藥液充分搖勻。
當(dāng)測(cè)試杯排放好后(圖1、圖2),每個(gè)測(cè)試杯中加入5 mL藻液,進(jìn)行加藥前測(cè)溫記錄,每杯每次連測(cè)3個(gè)藻溫。然后滴加藥液,其中,蒸餾水毒性測(cè)試時(shí)用滴液管分別滴加蒸餾水1滴(約0.05 mL)于加藥組、對(duì)照組的測(cè)試杯中,重金屬毒性測(cè)試時(shí)用滴液管分別滴加藥液、蒸餾水各1滴于加藥組、對(duì)照組的測(cè)試杯中,立即進(jìn)行加藥后的測(cè)溫記錄,每次每杯連測(cè)3個(gè)藻溫。測(cè)溫時(shí),紅外測(cè)溫儀頭部距離藻液正上方10~15 cm,指示紅色光點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)藻液面中心時(shí)測(cè)溫。每杯每次連測(cè)3個(gè)藻溫,用于計(jì)算平均值。測(cè)溫順序:從上到下,從左到右。測(cè)溫遍數(shù):3個(gè)重復(fù)測(cè)溫完畢時(shí)即為測(cè)溫1遍。藥液滴入藻液后到藻產(chǎn)生響應(yīng)有一個(gè)過程,藻對(duì)不同藥液的響應(yīng)過程不同,加藥前測(cè)溫1遍,加藥后測(cè)溫9遍。前一遍測(cè)溫完成后接著下一遍測(cè)溫。
藻溫記錄:按照測(cè)試項(xiàng)目的測(cè)試杯布局方式、測(cè)溫要求制作藻溫記錄表,測(cè)溫時(shí)將藻溫記錄于表中。
1.3.1 藻溫處理方法
T=(Tn1+Tn2+Tn3)/3
(1)
Tni=(Tb1+Tb2+Tb3) /3
(2)
Tbi=(T1+T2+T3) /3
(3)
其中,T為每遍測(cè)溫的處理組藻溫;Tn1、Tn2、Tn3分別為3次重復(fù)的平均藻溫;Tni為重復(fù)組的平均藻溫,i=1,2,3;Tb1、Tb2、Tb3分別為空白、對(duì)照、加藥的測(cè)試杯的平均藻溫;Tbi為每個(gè)測(cè)試杯的平均藻溫,i=1,2,3;Ti為每個(gè)測(cè)試杯連續(xù)測(cè)試的藻溫(3個(gè)藻溫),i=1,2,3。
1.3.2 藻溫差計(jì)算方法
ΔT=∣ΔTj∣-∣ΔTd∣, ΔT>0
(4)
ΔTj=(Tj- ti-Tj-t0)-(Tk-ti-Tk-t0)
(5)
ΔTd=(Td-ti-Td-t0)-(Tk-ti-Tk-t0)
(6)
上式(4)、(5)、(6)分別為藻響應(yīng)溫差,加藥組藻溫差和對(duì)照組藻溫差的計(jì)算方法。其中,Tj-ti為加藥后加藥組的藻溫;Tj-t0為加藥前加藥組的藻溫;Tk-ti為加藥后空白組的藻溫;Tk-t0為加藥前空白組的藻溫;Td-ti為加水后對(duì)照組的藻溫;Td-t0為加水前對(duì)照組的藻溫;j為加藥組,滴加藥液;d為對(duì)照組,滴加蒸餾水;k為空白組,不滴加藥液或蒸餾水;ti為測(cè)溫遍數(shù),i=0,為加藥前的測(cè)溫;i=1, 2,…,9為加藥后第1, 2,…,9遍測(cè)溫。
1.3.3 藻對(duì)藥液響應(yīng)的三指標(biāo)評(píng)價(jià)法
當(dāng)藻溫差同時(shí)滿足下面3個(gè)指標(biāo)時(shí),即為藻對(duì)藥液產(chǎn)生響應(yīng)。
指標(biāo)①—最大藻溫差比較值,即加藥后9遍測(cè)溫中,︱ΔTj-max︱>︱ΔTd-max︱。
指標(biāo)③—藻響應(yīng)率(ψ)≥55%,即加藥后9遍測(cè)溫中,∣ΔTj∣>∣ΔTd∣的出現(xiàn)次數(shù)≥5。
1.3.4 首測(cè)結(jié)果的再現(xiàn)性、最終測(cè)試結(jié)果的重現(xiàn)性
首測(cè)結(jié)果的再現(xiàn)性用于分析第一次測(cè)試結(jié)果的可信性,最終測(cè)試結(jié)果的重現(xiàn)性用于分析最終測(cè)試結(jié)果的可靠性。
首測(cè)結(jié)果的再現(xiàn)性=(與首測(cè)結(jié)果相同的結(jié)果數(shù)/實(shí)驗(yàn)數(shù))×100%
再現(xiàn)性的出現(xiàn)率=(具有再現(xiàn)性的結(jié)果數(shù)/總結(jié)果數(shù))×100%
最終測(cè)試結(jié)果的重現(xiàn)性=(相同結(jié)果數(shù)/實(shí)驗(yàn)數(shù))×100%
重現(xiàn)性的出現(xiàn)率=(具有重現(xiàn)性的結(jié)果數(shù)/總結(jié)果數(shù))×100%
1.3.5 聯(lián)合作用最終測(cè)試結(jié)果的確認(rèn)
在3次相同測(cè)試中,具有重現(xiàn)性的結(jié)果即為聯(lián)合作用最終測(cè)試結(jié)果。
1.4.1 聯(lián)合作用指數(shù)偏差法
二元聯(lián)合作用采用聯(lián)合作用指數(shù)偏差法進(jìn)行評(píng)價(jià)。聯(lián)合作用指數(shù)(θ)的計(jì)算式為
(7)
其中,θ為聯(lián)合作用指數(shù);△TABmax為A、B藥聯(lián)合時(shí)產(chǎn)生的藻最大響應(yīng)溫差;△TA為△TABmax出現(xiàn)的測(cè)溫遍數(shù)時(shí),A藥的藻響應(yīng)溫差;△TB為△TABmax出現(xiàn)的測(cè)溫遍數(shù)時(shí),B藥的藻響應(yīng)溫差。
1.4.2 評(píng)價(jià)方法
θ> 1+f
協(xié)同作用(Synergistic effect)
1-f≤θ≤ 1+f
相加作用(Additive effect)
當(dāng)θ<1-f時(shí):
△TABmax △TABmax>max(△TA, △TB) 獨(dú)立作用(Independent effect) 1.4.3 用于聯(lián)合作用指數(shù)θ分析的藻響應(yīng)溫差 θ分析用的聯(lián)合藥液的藻響應(yīng)溫差:聯(lián)合藥液的藻響應(yīng)通過三指標(biāo)法,在9遍測(cè)溫結(jié)果中最大的藻響應(yīng)溫差(△TABmax)用于θ分析。 游粱式抽油機(jī)具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單和可靠性高等優(yōu)點(diǎn),使其在采油設(shè)備中有廣泛的應(yīng)用。抽油機(jī)都采用較大功率驅(qū)動(dòng)電機(jī)來解決啟動(dòng)問題,但正常運(yùn)行時(shí)效率低下。抽油機(jī)的數(shù)量巨大,因而抽油機(jī)的節(jié)能降耗研究具有重要的意義[1]。為此進(jìn)行了大量的探索,這些探索工作可以分成兩類,對(duì)抽油機(jī)機(jī)械結(jié)構(gòu)的優(yōu)化和對(duì)電機(jī)運(yùn)行特性的改善。當(dāng)抽油機(jī)上沖程時(shí)電機(jī)處于電動(dòng)狀態(tài);下沖程時(shí),電機(jī)處于發(fā)電狀態(tài)會(huì)產(chǎn)生“泵升電壓”。這部分能量通常采用外接功率電阻,以能耗制動(dòng)的方式將這部分能量消耗掉。雖然這種方案結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,容易實(shí)現(xiàn),但是功耗電阻的發(fā)熱有可能引發(fā)安全問題并縮短設(shè)備壽命,更重要的是造成了能量的浪費(fèi)不利于油田的節(jié)能降耗。 θ分析用的單藥藥液的藻響應(yīng)溫差:指標(biāo)①中最大藻響應(yīng)溫差(△TABmax)出現(xiàn)時(shí)刻(測(cè)溫遍數(shù))的單藥的藻響應(yīng)溫差(△TA、△TB)用于θ分析。單藥的藻響應(yīng)溫差0時(shí),以0計(jì)。當(dāng)△TA=0、△TB=0同時(shí)出現(xiàn)時(shí),重新測(cè)試藻溫。 步驟依次為參照濃度分析、聯(lián)合作用測(cè)試、聯(lián)合作用評(píng)價(jià)和重現(xiàn)性分析。 1.5.1 參照濃度的分析 參照濃度是指聯(lián)合作用測(cè)試時(shí)藥液濃度的配制標(biāo)準(zhǔn)。分析步驟依次為藻響應(yīng)藥品的濃度梯度分析、敏感濃度分析和參照濃度分析。 (1)藻響應(yīng)藥品濃度梯度的分析 圖1 倍半濃度梯度的測(cè)試杯布局Fig. 1 Arrangement of cups in test 藥液濃度梯度設(shè)計(jì)為N、N/2、N/4、N/8、N/16、N/32 (單位為g·L-1),即倍半濃度梯度法。測(cè)試杯布局見圖1。 藻溫測(cè)試方法見1.2,藻溫現(xiàn)測(cè)現(xiàn)記。藻溫分析可用軟件分析,將測(cè)試的藻溫輸入AITAS 軟件,分析藻響應(yīng)藥品濃度范圍。藻溫分析也可用人工分析,將測(cè)試的藻溫用1.3.2、1.3.3方法分析藻響應(yīng)藥品濃度范圍。如果沒有找到藻響應(yīng)藥品濃度范圍,重新設(shè)計(jì)藥液濃度梯度再測(cè)試。 (2)藻響應(yīng)藥品的敏感濃度分析 藻響應(yīng)藥品的敏感濃度(簡(jiǎn)稱敏感濃度)是指藥品濃度增減引起藻響應(yīng)溫差增減的藥品濃度。首先進(jìn)行同藥倍半關(guān)系濃度的初步分析。同藥倍半關(guān)系濃度是指引起藻響應(yīng)溫差倍半變化的同一種藥的倍半濃度。因同藥一分為二測(cè)得的聯(lián)合作用為相加作用,用它來分析藥品的敏感濃度??梢杂密浖治觯瑢y(cè)試的藻溫輸入AITHCAS,分析藥品的同藥倍半關(guān)系濃度。也可用人工分析,將測(cè)試的藻溫用1.3.2、1.3.3方法分析各濃度的藻響應(yīng)溫差,再用1.4.3的方法,找出聯(lián)合藥液的最大藻響應(yīng)溫差、單藥藥液的藻響應(yīng)溫差,進(jìn)行聯(lián)合作用指數(shù)θ計(jì)算(由于只有1個(gè)單藥的藻響應(yīng)溫差,計(jì)算時(shí)單藥的藻響應(yīng)溫差用乘以2來處理),再根據(jù)聯(lián)合作用評(píng)價(jià)方法(1.4.2)分析同藥倍半關(guān)系濃度是否為相加作用。分析結(jié)果為相加作用,進(jìn)行下一步分析。否則,重新測(cè)試。 接下來進(jìn)行同藥倍半關(guān)系濃度的再現(xiàn)性分析。對(duì)初步分析的同藥倍半關(guān)系濃度再進(jìn)行2次相同測(cè)試,如相加作用結(jié)果能夠再現(xiàn),即通過再現(xiàn)性分析。這時(shí)同藥倍半關(guān)系濃度就是藻響應(yīng)藥品的敏感濃度,可進(jìn)行聯(lián)合作用測(cè)試時(shí)藥液配制的參照濃度分析。 圖2 二元聯(lián)合作用的測(cè)試杯布局Fig. 2 Arrangement of cups in binary combined effect test 測(cè)試杯布局見圖2,藻溫測(cè)試方法見1.2。相加作用分析可采用軟件分析,將測(cè)試藻溫輸入軟件AICEAS,分析相加作用。也可采用人工分析,將測(cè)試藻溫用1.3.2、1.3.3方法分析各濃度的藻響應(yīng)溫差,再用1.4.3的方法,找出聯(lián)合藥液的最大藻響應(yīng)溫差、單藥藥液的藻響應(yīng)溫差,進(jìn)行聯(lián)合作用指數(shù)θ計(jì)算,根據(jù)聯(lián)合作用評(píng)價(jià)方法(1.4.2)分析相加作用。如果分析結(jié)果為相加作用,即可進(jìn)行參照濃度分析。 參照濃度確定的原則為在測(cè)試的2種藥品中,以毒性大的藥品的同藥倍半關(guān)系濃度的倍濃度、半濃度作為聯(lián)合藥液、單藥液配制的參照濃度。聯(lián)合藥液[A+B]=單藥液[A]+單藥液[B],其中,單藥液[A]=單藥液[B]。參照濃度確定的方法為比較2種藥品的同藥倍半關(guān)系濃度,找出其濃度小藥品(即毒性大的藥品),以其倍濃度、半濃度作為測(cè)試用的聯(lián)合藥液、單藥液配制的參照濃度。比如,測(cè)試同藥倍半關(guān)系濃度(g·L-1)時(shí),A為4:2,B為2:1,B小于A,即B毒性大于A,根據(jù)參照濃度確定原則,以B的同藥倍半關(guān)系濃度作為測(cè)試藥液配制的參照濃度,聯(lián)合藥液濃度:單藥液的參照濃度為2:1。 1.5.2 聯(lián)合作用測(cè)試 (1) 藥液配制 按參照濃度確定的原則和方法配制測(cè)試藥液的濃度(1.5.1(1))。 (2) 藻溫測(cè)試 測(cè)試杯布局見圖2;藻溫測(cè)試方法見1.2。 (3) 藻溫分析 軟件分析:將測(cè)試藻溫輸入軟件AICEAS,進(jìn)行聯(lián)合作用類型分析。 人工分析:將測(cè)試藻溫用1.3.2、1.3.3方法分析各濃度的藻響應(yīng)溫差,再用1.4.3的方法,找出聯(lián)合藥液的最大藻響應(yīng)溫差、單藥藥液的藻響應(yīng)溫差,進(jìn)行聯(lián)合作用指數(shù)θ計(jì)算。 1.5.3 聯(lián)合作用測(cè)試 根據(jù)聯(lián)合作用評(píng)價(jià)方法(1.4.2)分析聯(lián)合作用類型。 1.5.4 測(cè)試結(jié)果的重現(xiàn)性分析 首次聯(lián)合作用測(cè)試完成后,再進(jìn)行2次相同測(cè)試,以有重現(xiàn)性的聯(lián)合作用類型作為最終測(cè)試結(jié)果。 2.1.1 藻響應(yīng)的重金屬濃度梯度 由表1可知,藻響應(yīng)的重金屬濃度(g·L-1)梯度中Cu(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、Hg(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)和Pb(Ⅱ)均為8、4、2、1、0.5、0.25;Fe(Ⅲ)為8、4、2、1;Al(Ⅲ)為8、1、0.5、0.25;Cr(Ⅲ)為8、4、2、0.25;Zn(Ⅱ)為8、4、2、0.5、0.25。 2.1.2 初步分析的同藥(重金屬)倍半關(guān)系濃度 由表2可知,初步分析的同藥倍半關(guān)系濃度(g·L-1)中,Cd(Ⅱ)、Cr(Ⅲ)、Fe(Ⅲ)、Pb(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)為2:1,Al(Ⅲ)、Mn(Ⅱ)為1:0.5,Cu(Ⅱ)、Hg(Ⅱ)為0.5:0.25。 2.1.3 同藥倍半關(guān)系濃度的驗(yàn)證分析 由表3可知,同藥倍半關(guān)系濃度初步分析結(jié)果的再現(xiàn)性測(cè)試中,8種首測(cè)結(jié)果為相加作用的都具有再現(xiàn)性,首測(cè)結(jié)果相加作用的出現(xiàn)率為89%,表明首測(cè)結(jié)果的可信性高。1種首測(cè)結(jié)果為拮抗作用的沒有再現(xiàn)性,但最終結(jié)果為相加作用,且具有重現(xiàn)性。 表1 藻響應(yīng)重金屬的測(cè)試結(jié)果Table 1 Test results of algae response to heavy metals 注:藻對(duì)藥液有響應(yīng)用“+”表示,藻對(duì)藥液無響應(yīng)用“-”表示。測(cè)試藻為滇池銅綠微囊藻,藻密度≥3.14×109個(gè)·L-1,環(huán)境溫度為17.5 ℃~25.4 ℃。 Note: “+”, algae responds to liquid, “-”, algae didn’t respond to liquid; algae in test isMicrocystisaeruginosain Dianchi Lake in China; algal density is no less than 3.14×109cells·L-1;environmental temperature is between 17.5 ℃ and 25.4 ℃. 表2 同藥倍半關(guān)系濃度初步分析結(jié)果Table 2 Preliminary analysis results of concentration relation for the same medicine 注:有相加作用為“+”,無相加作用為“-”。測(cè)試藻為滇池銅綠微囊藻;藻密度≥3.14×109個(gè)·L-1;環(huán)境溫度為17.5 ℃~25.4 ℃。 Note: Additive effect is "+", no additive effect is "-"; algae in test isMicrocystisaeruginosain Dianchi Lake in China; algal density is no less than 3.14×109cells·L-1; environmental temperature is between 17.5 ℃ and 25.4 ℃. 通過再現(xiàn)性分析的同藥倍半關(guān)系濃度(g·L-1)中,Cd(Ⅱ)、Cr(Ⅲ)、Fe(Ⅲ)、Pb(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)均為2:1;Al(Ⅲ)、Mn(Ⅱ)為1:0.5,Cu(Ⅱ)、Hg(Ⅱ)為0.5:0.25。根據(jù)敏感濃度定義,這些重金屬倍半關(guān)系濃度就是藻響應(yīng)的敏感濃度。 2.1.4 藥液配制的參照濃度 由表4可知:①聯(lián)合藥液參照濃度:單藥液參照濃度=0.5:0.25(g·L-1)的二元組合是:Cu2++Fe3+、Cu2++Mn2+、Cu2++Hg2+、Cu2++Cd2+、Cu2++Pb2+、Cu2++Zn2+、Fe3++Hg2+、Mn2++Hg2+、Al3++Hg2+、Cr3++Hg2+、Cu2++Al3+、Cu2++Cr3+、Hg2++Cd2+、Hg2++Pb2+、Hg2++Zn2+。②聯(lián)合藥液參照濃度:單藥液參照濃度=2.0:1.0(g·L-1)的二元組合是: Cr3++Cd2+、Cd2++Zn2+、Pb2++Zn2+、Cr3++Pb2+、Fe3++Cd2+、Fe3++Cr3+、Fe3++Pb2+、Fe3++Zn2+、Cr3++Zn2+、Cd2++Pb2+。③聯(lián)合藥液參照濃度:單藥液參照濃度=1.0:0.5(g·L-1)的二元組合是:Fe3++Mn2+、Fe3++Al3+、Mn2++Cd2+、Al3++Cr3+、Al3++Cd2+、Al3++Pb2+、Al3++Zn2+、Mn2++Al3+、Mn2++Cr3+、Mn2++Pb2+、Mn2++Zn2+。 由表3可知,在9種重金屬的同藥倍半關(guān)系濃度分析中8種重金屬的首測(cè)結(jié)果為相加作用,其中6種首測(cè)結(jié)果的再現(xiàn)性為100%,另2種再現(xiàn)性為50%,全部首測(cè)結(jié)果再現(xiàn)性的出現(xiàn)率為89%;9種相加作用結(jié)果中,6種的重現(xiàn)性為100%,3種的重現(xiàn)性為67%;9種相加作用結(jié)果重現(xiàn)性的出現(xiàn)率為100%。分析表明,二元聯(lián)合作用藻紅外測(cè)試方法的測(cè)試效果較好。 表3 同藥倍半關(guān)系濃度的再現(xiàn)性分析結(jié)果Table 3 Reproducibility analysis results of concentration relation for the same medicine 注:測(cè)試藻為滇池銅綠微囊藻;藻密度≥3.14×109個(gè)·L-1;環(huán)境溫度為17.5 ℃~25.4 ℃。 Note: algae in test isMicrocystisaeruginosain Dianchi Lake in China; algal density is no less than 3.14×109cells·L-1; environmental temperature is between 17.5 ℃ and 25.4 ℃. 表4 重金屬二元聯(lián)合作用藻紅外測(cè)試分析結(jié)果Table 4 Analysis results of binary combined effects of heavy metals in algae infrared test 續(xù)表聯(lián)合作用測(cè)試藥液Jointactiontestsolution第1次實(shí)驗(yàn)Firstexperiment第2次實(shí)驗(yàn)Secondexperiment第3次實(shí)驗(yàn)Thirdexperiment二元組合Binarycombination參照濃度[兩藥]:[單藥]/(g·L-1)ReferenceconcentrationTwodrugs:Onedrug/(g·L-1)指數(shù)Index(θ)類型Type指數(shù)Index(θ)類型Type指數(shù)Index(θ)類型Type再現(xiàn)率Reappearancerate重現(xiàn)率Recurrencerate結(jié)果Result再現(xiàn)性的出現(xiàn)率Occurrencerateofreappearance重現(xiàn)性的出現(xiàn)率Occurrencerateofrecurrence總再現(xiàn)性出現(xiàn)率Totalrateofreappearance總重現(xiàn)性出現(xiàn)率TotalrateofrecurrenceCr3+,Pb2+2.0:1.00.51獨(dú)立Indepedent1.60協(xié)同Synergism1.90協(xié)同Synergism0%67%協(xié)同SynergismCu2+,Al3+0.5:0.251.09相加Additive0.34拮抗Antagonism0.09拮抗Antagonism0%67%拮抗AntagonismCu2+,Cr3+0.5:0.250.56拮抗Antagonism0.54拮抗Antagonism1.54協(xié)同Synergism50%67%拮抗AntagonismFe3+,Cr3+2.0:1.00.09拮抗Antagonism0.56拮抗Antagonism1.67協(xié)同Synergism50%67%拮抗AntagonismFe3+,Pb2+2.0:1.00.39拮抗Antagonism0.56拮抗Antagonism1.65協(xié)同Synergism50%67%拮抗AntagonismFe3+,Zn2+2.0:1.00.08拮抗Antagonism0.43拮抗Antagonism0.15拮抗Antagonism100%100%拮抗AntagonismMn2+,Al3+1.0:0.50.49拮抗Antagonism0.93相加Additive0.55拮抗Antagonism50%67%拮抗AntagonismMn2+,Cr3+1.0:0.50.57拮抗Antagonism0.28拮抗Antagonism1.60協(xié)同Synergism50%67%拮抗AntagonismMn2+,Pb2+1.0:0.50.35拮抗Antagonism1.06相加Additive0.36拮抗Antagonism50%67%拮抗AntagonismMn2+,Zn2+1.0:0.50.50拮抗Antagonism1.42相加Additive0.37拮抗Antagonism50%67%拮抗AntagonismCr3+,Zn2+2.0:1.00.42拮抗Antagonism0.56拮抗Antagonism0.35拮抗Antagonism100%100%拮抗AntagonismHg2+,Cd2+0.5:0.250.40拮抗Antagonism0.25拮抗Antagonism1.43協(xié)同Synergism50%67%拮抗AntagonismHg2+,Pb2+0.5:0.250.27拮抗Antagonism0.50拮抗Antagonism0.66相加Additive50%67%拮抗AntagonismHg2+,Zn2+0.5:0.250.37拮抗Antagonism0.33拮抗Antagonism0.54拮抗Antagonism100%100%拮抗AntagonismCd2+,Pb2+2.0:1.00.49拮抗Antagonism0.30拮抗Antagonism0.90相加Additive50%67%拮抗Antagonism0100%93%100% 注:測(cè)試藻為滇池銅綠微囊藻;藻密度≥3.14×109個(gè)·L-1;環(huán)境溫度為17.5 ℃~25.4 ℃。 Note: algae in test isMicrocystisaeruginosain Dianchi Lake in China; algal density is no less than 3.14×109cells·L-1; environmental temperature is between 17.5 ℃ and 25.4 ℃. 由表5可知,在36組的聯(lián)合作用測(cè)試結(jié)果中,出現(xiàn)拮抗、相加、協(xié)同3種聯(lián)合作用類型,測(cè)試結(jié)果出現(xiàn)多樣性;14組拮抗作用中單組的再現(xiàn)性為50%~100%、多組的再現(xiàn)性的出現(xiàn)率為93%,單組的重現(xiàn)性為67%~100%、多組的重現(xiàn)性的出現(xiàn)率為100%,21組相加作用中單組的再現(xiàn)性為50%~100%、多組的再現(xiàn)性的出現(xiàn)率為86%,單組的重現(xiàn)性為67%~100%、多組的重現(xiàn)性的出現(xiàn)率為100%,1組協(xié)同作用的重現(xiàn)性為100%、重現(xiàn)性的出現(xiàn)率為100%;36組聯(lián)合作用測(cè)試結(jié)果的再現(xiàn)性為50%~100%、再現(xiàn)性的出現(xiàn)率為86%,重現(xiàn)性為67%~100%、重現(xiàn)性的出現(xiàn)率為100%。分析表明,二元聯(lián)合作用藻紅外測(cè)試方法的測(cè)試效果良好。 在同藥倍半關(guān)系濃度測(cè)試中(2.2),相加作用結(jié)果的再現(xiàn)性、再現(xiàn)性的重現(xiàn)率和重現(xiàn)性、重現(xiàn)性的重現(xiàn)率都比較好。在聯(lián)合作用測(cè)試結(jié)果中出現(xiàn)的相加、拮抗、協(xié)同的聯(lián)合作用類型,每一種類型的再現(xiàn)性、再現(xiàn)性的重現(xiàn)率和重現(xiàn)性、重現(xiàn)性的重現(xiàn)率都比較好(2.3)。藻紅外測(cè)試技術(shù)有較好的測(cè)試效果,并細(xì)化了測(cè)試條件,改進(jìn)了藻溫測(cè)試方法,提出了三指標(biāo)評(píng)價(jià)法和參照濃度分析方法,修正了聯(lián)合作用偏差f值的結(jié)果。這樣,改進(jìn)后的藻溫測(cè)試方法、三指標(biāo)評(píng)價(jià)方法、重現(xiàn)性分析能夠保證藻響應(yīng)溫差和藻響應(yīng)藥品評(píng)價(jià)結(jié)果的質(zhì)量,參照濃度分析方法、二元聯(lián)合作用評(píng)價(jià)方法、重現(xiàn)性分析能夠控制聯(lián)合作用分析結(jié)果的質(zhì)量。 在聯(lián)合作用測(cè)試結(jié)果中出現(xiàn)了相加、拮抗、協(xié)同3種聯(lián)合作用類型,占4種聯(lián)合作用的75%,表現(xiàn)出一定的多樣性。當(dāng)有多種聯(lián)合作用類型出現(xiàn)時(shí),并且每一種類型具有較好的再現(xiàn)性、重現(xiàn)性,表明聯(lián)合作用評(píng)價(jià)法的f值=0.42是恰當(dāng)?shù)?。?dāng)測(cè)試結(jié)果沒有多樣性時(shí),表明f值過小或過大。 聯(lián)合作用分析需要定量測(cè)出藥品參照濃度(敏感濃度)引起的藻響應(yīng)溫差。因此,測(cè)試聯(lián)合作用最為關(guān)鍵的是藥液配制的標(biāo)準(zhǔn),而參照濃度就是藥液配制的標(biāo)準(zhǔn)和依據(jù),沒有參照濃度聯(lián)合作用測(cè)試便無可控性,也就沒有可信的測(cè)試結(jié)果,參照濃度在聯(lián)合作用測(cè)試中非常重要,因此它是聯(lián)合作用測(cè)試的關(guān)鍵技術(shù)。由于藻響應(yīng)的有毒有害物都存在敏感濃度,那么,用參照濃度分析方法就可找出不同有毒有害物的參照濃度,因此藻紅外測(cè)試技術(shù)可用于測(cè)試重金屬、農(nóng)藥、有機(jī)化學(xué)藥品、抗生素等的二元聯(lián)合作用。 在測(cè)試1組二元聯(lián)合作用時(shí),配制藥液的參照濃度測(cè)試、聯(lián)合作用測(cè)試、重現(xiàn)性分析測(cè)試中,測(cè)試的藻溫?cái)?shù)據(jù)巨大,而且不同數(shù)據(jù)需要專門分析,因此采用軟件處理即可提高分析速度又可避免人工分析易出現(xiàn)的差錯(cuò),因此數(shù)據(jù)處理軟件是二元聯(lián)合作用藻紅外測(cè)試技術(shù)的重要組成部分。 綜上分析,二元聯(lián)合作用測(cè)試結(jié)果具有較好的多樣性、再現(xiàn)性、重現(xiàn)性,這是由于測(cè)試條件、藻溫測(cè)試方法、藻響應(yīng)溫差評(píng)價(jià)方法能夠保證藻響應(yīng)溫差的質(zhì)量,參照濃度分析方法、聯(lián)合作用評(píng)價(jià)方法、重現(xiàn)性分析等能夠控制聯(lián)合作用測(cè)試結(jié)果的質(zhì)量。藻紅外技術(shù)測(cè)試重金屬二元聯(lián)合作用是可行的。參照濃度作為藥液配制的標(biāo)準(zhǔn)是可行的,在聯(lián)合作用分析中不可或缺。藻響應(yīng)的有毒有害物都存在敏感濃度,用參照濃度分析方法可分析出藻響應(yīng)有毒有害物的參照濃度,因此,藻紅外測(cè)試技術(shù)可用于測(cè)試重金屬、農(nóng)藥、有機(jī)化學(xué)藥品、抗生素等的二元聯(lián)合作用。聯(lián)合作用藻紅外測(cè)試中,用AITAS軟件、AITHCAS軟件、AICEAS軟件將大大提高數(shù)據(jù)處理分析的效率。 [1] Beyer J, Jonsson G, Porte C, et al. 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2 結(jié)果(Results)
2.1 參照濃度分析結(jié)果
2.2 同藥倍半關(guān)系濃度的再現(xiàn)性和重現(xiàn)性
2.3 測(cè)試結(jié)果的多樣性、再現(xiàn)性、重現(xiàn)性
3 討論(Discussion)
3.1 測(cè)試結(jié)果的再現(xiàn)性與重現(xiàn)性
3.2 測(cè)試結(jié)果的多樣性
3.3 參照濃度及其分析方法的意義
3.4 軟件開發(fā)的必要性