鄧林，龔玲，楊家書(shū)，賴(lài)詩(shī)韻，陳陽(yáng)，林居純

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院, 成都 611130

復(fù)方阿苯達(dá)唑/伊維菌素作為生豬養(yǎng)殖上常用的寄生蟲(chóng)病防治藥物，具有良好的藥效，能驅(qū)殺大部分的線蟲(chóng)、絳蟲(chóng)及節(jié)肢動(dòng)物，其主要成分為阿苯達(dá)唑和伊維菌素。其中，伊維菌素主要對(duì)各種線蟲(chóng)和節(jié)肢動(dòng)物具有良好的驅(qū)殺作用[1]，而阿苯達(dá)唑則主要對(duì)線蟲(chóng)和絳蟲(chóng)等具有明顯的驅(qū)殺作用[2]。相關(guān)的毒理學(xué)研究顯示，伊維菌素通過(guò)與哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的門(mén)控氯離子通道結(jié)合增加γ-氨基丁酸的釋放，從而產(chǎn)生中樞毒性[3-4]。而阿苯達(dá)唑則能與細(xì)胞中的微球蛋白結(jié)合阻斷微絲的形成，或者干擾糖原的合成[5-6]。Gao等[7]發(fā)現(xiàn)土壤中殘留的阿苯達(dá)唑及其代謝產(chǎn)物能影響生態(tài)環(huán)境中的哨兵動(dòng)物——蚯蚓的繁殖，表明其具有一定程度的環(huán)境危害。目前，關(guān)于復(fù)方阿苯達(dá)唑/伊維菌素的毒理學(xué)研究較少。為了解阿苯達(dá)唑和伊維菌素組成復(fù)方后致突變性的變化情況，同時(shí)也為獸醫(yī)臨床使用和環(huán)境危害評(píng)估提供參考。通過(guò)Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓微核試驗(yàn)、小鼠精子畸變?cè)囼?yàn)對(duì)復(fù)方阿苯達(dá)唑/伊維菌素及其單藥進(jìn)行了體內(nèi)外的致突變性研究。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 受試系統(tǒng)

健康昆明種小鼠，SPF級(jí)，購(gòu)自成都達(dá)碩生物科技有限公司，動(dòng)物合格號(hào)：0016916。組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門(mén)氏菌株TA97、TA98、TA100、TA102，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家新獸藥安全評(píng)價(jià)中心惠贈(zèng)。

1.2 受試藥物

伊維菌素，純度≥95.4%，批號(hào)：CN01315；阿苯達(dá)唑，純度≥99.0%，批號(hào)：140928，以上藥物由拜耳(四川)動(dòng)物保健有限公司惠贈(zèng)。復(fù)方阿苯達(dá)唑/伊維菌素按拜耳(四川)動(dòng)物保健有限公司提供配方制備，其中阿苯達(dá)唑和伊維菌素比例為24:1。用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液將阿苯達(dá)唑和伊維菌素按比例配成不同濃度的復(fù)方阿苯達(dá)唑/伊維菌素混懸液備用。

1.3 試劑

敵克松，純度>98%，購(gòu)自Sigma-Aldrich上海(貿(mào)易)有限公司；二氨基芴，純度>98%，購(gòu)自Sigma-Aldrich上海(貿(mào)易)有限公司；1,8-二羥基蒽醌，純度>96%，購(gòu)自Sigma-Aldrich上海(貿(mào)易)有限公司；疊氮鈉，純度>99.5%，購(gòu)自博大泰克生物技術(shù)有限公司；注射用環(huán)磷酰胺，購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；二甲亞砜，分析純，購(gòu)自西隴化工股份有限公司；甲醇，分析純，購(gòu)自西隴化工股份有限公司；滅活小牛血清，購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司；羧甲基纖維素鈉，分析純，購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠；吉姆薩染色液和2%伊紅染液為自配。S9為本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)多氯聯(lián)苯(PCB)誘導(dǎo)大鼠獲得的肝臟勻漿上清液，且經(jīng)鑒定合格[8]。

1.4 Ames試驗(yàn)

采用組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門(mén)氏菌的TA97、TA98、TA100、TA102作為本次試驗(yàn)的檢測(cè)菌株。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用二甲亞砜分別溶解伊維菌素、阿苯達(dá)唑和復(fù)方阿苯達(dá)唑/伊維菌素并配制成50.00 mg·mL-1的溶液。以該濃度為最高濃度，將3種受試藥物溶液分別按5倍比例稀釋成10.00 mg·mL-1、2.00 mg·mL-1、0.40 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1系列濃度，溶劑對(duì)照組為二甲亞砜，不加S9的TA97、TA98、TA102的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照為敵克松(每個(gè)培養(yǎng)皿中50.00 μg)、不加S9的TA100標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照為疊氮鈉(每個(gè)培養(yǎng)皿中1.50 μg)、加S9的TA97、TA98、TA100的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照為二氨基芴(每個(gè)培養(yǎng)皿中10.00 μg)，加S9的TA102的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照為1,8-二羥基蒽醌(每個(gè)培養(yǎng)皿中50.00 μg)。另設(shè)空白對(duì)照以觀察自發(fā)回變菌落數(shù)。分別取0.1 mL增菌液和受試藥物加入2 mL頂層培養(yǎng)基中混勻后，倒入底層培養(yǎng)基并均勻覆蓋。于37 ℃生化培養(yǎng)箱中經(jīng)過(guò)48 h培養(yǎng)后，計(jì)數(shù)每皿回變菌落數(shù)。試驗(yàn)將在含有S9不含S9 這2種不同代謝活化條件下進(jìn)行，每個(gè)劑量3個(gè)平行[8]。

1.5 骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

70只體重在18～22 g的健康昆明小鼠按體重隨機(jī)分為7組，每組10只，雌雄各半。根據(jù)先前急性毒性試驗(yàn)結(jié)果(半數(shù)致死量，LD50=1 501.18 mg·kg-1)設(shè)復(fù)方阿苯達(dá)唑/伊維菌素組高、中、低劑量分別為360.28/15.01 mg·kg-1(1/4LD50)，180.14/7.51 mg·kg-1(1/8LD50)和90.07/3.75 mg·kg-1(1/16LD50)，并以高劑量組各成分對(duì)應(yīng)的劑量分別作為伊維菌素單藥組(15.01 mg·kg-1)和阿苯達(dá)唑單藥組(360.28 mg·kg-1)的劑量，以比較單藥與復(fù)方的毒性差異。用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液將藥物制備成混懸液。另設(shè)陰性對(duì)照組(0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液)和環(huán)磷酰胺(CP)陽(yáng)性對(duì)照(40.00 mg·kg-1)。

表1 復(fù)方阿苯達(dá)唑/伊維菌素Ames試驗(yàn)各組菌落計(jì)數(shù)Table 1 The bacteria counting of compound albendazole and ivermectin groups in Ames test (±SD)

注： “/”表示不加S9的TA97、TA98、TA102，其標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照敵克松劑量為50.00 μg·皿-1；不加S9的TA100，其標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照疊氮鈉劑量為1.50 μg·皿-1；加S9的TA97、TA98、TA100，其標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照二氨基芴的劑量為10.00 μg·皿-1；加S9的TA102，其標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照1,8-二羥基蒽醌的劑量為50.00 μg·皿-1。

Note： “/” in the table indicated Dexon, the positive control of TA97, TA98 and TA102 without S9, added into the plate was 50.00 μg·plate-1; NaN3, the positive control of TA100 without S9, added into the plate was 1.50 μg·plate-1; 2-Aminofluorene, the positive control of TA97, TA98 and TA100 with S9, added into the plate was 10.00 μg·plate-1; 1,8-Dihydroxyanthraquinone, the positive control of TA102 with S9, added into the plate was 50.00 μg·plate-1.

表2 伊維菌素Ames試驗(yàn)各組菌落計(jì)數(shù)Table 2 The bacteria counting of ivermectin groups in Ames test (±SD)

注： “/”表示不加S9的TA97、TA98、TA102，其標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照敵克松劑量為50.00 μg·皿-1；不加S9的TA100，其標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照疊氮鈉劑量為1.50 μg·皿-1；加S9的TA97、TA98、TA100，其標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照二氨基芴的劑量為10.00 μg·皿-1；加S9的TA102，其標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照1,8-二羥基蒽醌的劑量為50.00 μg·皿-1。

Note： “/” in the table indicated Dexon, the positive control of TA97, TA98 and TA102 without S9, added into the plate was 50.00 μg·plate-1; NaN3, the positive control of TA100 without S9, added into the plate was 1.50 μg·plate-1; 2-Aminofluorene, the positive control of TA97, TA98 and TA100 with S9, added into the plate was 10.00 μg·plate-1; 1,8-Dihydroxyanthraquinone, the positive control of TA102 with S9, added into the plate was 50.00 μg·plate-1.

表3 阿苯達(dá)唑Ames試驗(yàn)各組菌落計(jì)數(shù)Table 3 The bacteria counting of albendazole groups in Ames test (±SD)

注：“/”表示不加S9的TA97、TA98、TA102，其標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照敵克松劑量為50.00 μg·皿-1；不加S9的TA100，其標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照疊氮鈉劑量為1.50 μg·皿-1；加S9的TA97、TA98、TA100，其標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照二氨基芴的劑量為10.00 μg·皿-1；加S9的TA102，其標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照1,8-二羥基蒽醌的劑量為50.00 μg·皿-1。

Note： “/” in the table indicated Dexon, the positive control of TA97, TA98 and TA102 without S9, added into the plate was 50.00 μg·plate-1; NaN3, the positive control of TA100 without S9, added into the plate was 1.50 μg·plate-1; 2-Aminofluorene, the positive control of TA97, TA98 and TA100 with S9, added into the plate was 10.00 μg·plate-1; 1,8-Dihydroxyanthraquinone, the positive control of TA102 with S9, added into the plate was 50.00 μg·plate-1.

表4 復(fù)方阿苯達(dá)唑/伊維菌素及其單藥對(duì)小鼠骨髓微核率的影響(n=10)Table 4 The effect of the combination and its components of albendazole and ivermectin on micronucleus rate in mice (n=10)

注： “*”表示與陰性對(duì)照組比較，差異顯著(0.01

Note： “*” indicated significant difference (0.01

各組均采用經(jīng)口灌胃染毒，灌胃容積為0.2 mL·(10 g)-1。采用30 h染毒法，于末次染毒后6 h處死小鼠。取小鼠股骨，去除兩端骨骺，用小牛血清反復(fù)吹洗骨髓于玻片上，常規(guī)涂片并自然干燥后經(jīng)甲醇固定，吉姆薩染色，油鏡下計(jì)數(shù)嗜多染紅細(xì)胞微核率、嗜多染紅細(xì)胞與正染紅細(xì)胞比值(PCE/NCE)[9,11]。

1.6 小鼠精子畸變?cè)囼?yàn)

35只體重在25～30 g的健康雄性昆明小鼠按體重隨機(jī)分為7組，每組5只。給藥組(復(fù)方阿苯達(dá)唑/伊維菌素、伊維菌素、阿苯達(dá)唑)、陰性對(duì)照組的劑量設(shè)置與給藥途徑同小鼠骨髓微核試驗(yàn)，給藥頻率為每日1次，連續(xù)給藥5 d。CP陽(yáng)性對(duì)照腹腔注射一次，劑量為50.00 mg·kg-1。在首次染毒后第35天處死小鼠，取兩側(cè)附睪制成涂片，經(jīng)甲醇固定后，伊紅染色，光鏡下計(jì)數(shù)精子總數(shù)及各類(lèi)畸形精子數(shù)。每只小鼠檢查1 000個(gè)精子，計(jì)算精子畸形率及畸形類(lèi)型構(gòu)成比[10-11]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及結(jié)果判定

Ames試驗(yàn)中，如在背景菌苔生長(zhǎng)良好條件下，受試回變菌落數(shù)增加一倍以上，并有劑量反應(yīng)關(guān)系或至少某一測(cè)試點(diǎn)超過(guò)對(duì)照2倍以上有可重復(fù)的并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的陽(yáng)性反應(yīng)，即可認(rèn)為該受試物為誘變陽(yáng)性[8]。

微核試驗(yàn)和精子畸變?cè)囼?yàn)的數(shù)據(jù)使用SAS 9.0軟件FREQ程序?qū)o藥各組與陰性對(duì)照組微核率和精子畸變率進(jìn)行差異性分析和趨勢(shì)檢驗(yàn)。對(duì)微核試驗(yàn)中的PCE/NCE比值進(jìn)行t檢驗(yàn)。PCE/NCE大于或等于1，說(shuō)明受試物對(duì)骨髓細(xì)胞沒(méi)有毒性，反之則有毒性；PCE/NCE小于0.05則結(jié)果不可信[9-10]。

2 結(jié)果(Results)

2.1 Ames試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)培養(yǎng)48 h的平板進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)所有平板上均可見(jiàn)生長(zhǎng)良好的背景菌苔，在加S9和不加S9條件下，復(fù)方阿苯達(dá)唑/伊維菌素及其單藥組任何濃度中均未發(fā)現(xiàn)回復(fù)突變菌落數(shù)超過(guò)陰性對(duì)照組2倍以上，同時(shí)，每株菌在加S9和不加S9的情況下也并未表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。以上表明，復(fù)方阿苯達(dá)唑/伊維菌素及其單藥對(duì)TA97、TA98、TA100、TA102菌株均無(wú)誘發(fā)突變作用(見(jiàn)表1，表2)。

2.2 骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

小鼠骨髓微核試驗(yàn)結(jié)果表明，CP陽(yáng)性對(duì)照組微核率明顯高于陰性對(duì)照組(P≤0.01)，顯示陽(yáng)性結(jié)果，PCE/NCE >0.05表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。復(fù)方組3個(gè)劑量下均引起嗜多染紅細(xì)胞微核率的升高，但只有高、中劑量組與陰性對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P≤0.01)。伊維菌素和阿苯達(dá)唑單藥組均明顯提高了微核率(P≤0.01)，但僅有阿苯達(dá)唑單藥組的微核率明顯高于相對(duì)應(yīng)的復(fù)方高劑量組(P≤0.01)。陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組PCE/NCE均大于1，復(fù)方各組及兩單藥組PCE/NCE均小于1，并明顯低于陰性對(duì)照組，說(shuō)明了伊維菌素、阿苯達(dá)唑及其復(fù)方均對(duì)骨髓細(xì)胞有一定抑制作用(見(jiàn)表3，表4)。

表5 復(fù)方阿苯達(dá)唑/伊維菌素及其單藥對(duì)小鼠精子畸形率的影響(n=5)Table 5 The effects of the combination and its components of albendazole and ivermectin on the sperm abnormalities of mice (n=5)

注：“*”表示與陰性對(duì)照組比較，差異顯著(0.01

Note： “*” indicated significant difference (0.01

2.3 小鼠精子畸變?cè)囼?yàn)

復(fù)方阿苯達(dá)唑/伊維菌素致小鼠精子畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果見(jiàn)表5、6。由表5可見(jiàn)，CP陽(yáng)性對(duì)照組精子畸形率明顯高于陰性對(duì)照，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。復(fù)方各組小鼠精子畸形率逐漸升高，其中高、中劑量組精子畸形率明顯高于陰性對(duì)照組(P≤0.01)有量效關(guān)系。兩單藥組的精子畸形率也明顯高于陰性對(duì)照組(P≤0.01)，在單藥組和復(fù)方組的比較中也發(fā)現(xiàn)，伊維菌素單藥組(0.01

3 討論(Discussion)

Ames試驗(yàn)是一種經(jīng)典的體外遺傳毒性評(píng)價(jià)方法，并以出現(xiàn)基因突變?yōu)樵囼?yàn)終點(diǎn),常用于檢測(cè)受試物是否具有致基因出現(xiàn)點(diǎn)突變能力[12]。已有的研究顯示，伊維菌素和阿苯達(dá)唑沒(méi)有致突變作用[6,13]。本次研究結(jié)果表明，在加與不加S9條件下，伊維菌素和阿苯達(dá)唑?qū)A97、TA98、TA100、TA102菌株均無(wú)誘發(fā)突變作用，與已有報(bào)道一致。而由二者按1:24形成的固定劑量復(fù)方也表現(xiàn)出與單藥一致的致突變陰性，表明伊維菌素與阿苯達(dá)唑在此比例下形成的復(fù)方其誘變性未發(fā)生改變。

微核是存在于胞漿中獨(dú)立的核小體，它是由染色體斷裂產(chǎn)生無(wú)著絲粒的斷片或由于紡錘絲斷裂造成一條或一組染色體滯留在胞質(zhì)中而形成，可由外界因素誘導(dǎo)或自發(fā)性產(chǎn)生[14]。小鼠骨髓微核試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方組總劑量高于187.65 mg·kg-1時(shí)能明顯提高小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞的微核率，且各劑量組PCE/NCE比值均小于1，表明復(fù)方阿苯達(dá)唑/伊維菌素對(duì)骨髓細(xì)胞有抑制作用。伊維菌素單藥組和阿苯達(dá)唑單藥組均明顯提高了微核率，與Ermler等[15]和Ashmawy等[16]的報(bào)道相一致。阿苯達(dá)唑作為一種已知的紡錘體抑制劑，其作用靶標(biāo)為紡錘絲[17]，顯然能造成微核的形成。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)伊維菌素能造成單股DNA斷裂[18]。因此，推測(cè)復(fù)方阿苯達(dá)唑/伊維菌素可能從紡錘體和DNA兩方面產(chǎn)生致突變作用，從而增強(qiáng)毒性。然而，對(duì)比復(fù)方組和單藥組的微核率發(fā)現(xiàn)，阿苯達(dá)唑單藥組的微核率明顯高于復(fù)方組，而伊維菌素單藥組的微核率與復(fù)方組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可見(jiàn)復(fù)方阿苯達(dá)唑/伊維菌素不但沒(méi)出現(xiàn)毒性增強(qiáng)，相較于單藥其毒性反而下降。

表6 復(fù)方阿苯達(dá)唑/伊維菌素及其單藥對(duì)小鼠精子畸形類(lèi)型構(gòu)成的影響(n=5)Table 6 The effects of the combination and its components of albendazole and ivermectin on the sperm abnormality types of mice (n=5)

小鼠精子致畸試驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方組總劑量高于187.65 mg·kg-1時(shí)精子畸形率明顯高于陰性對(duì)照組(P≤0.01)，且具有明顯的量效關(guān)系，說(shuō)明復(fù)方阿苯達(dá)唑/伊維菌素對(duì)小鼠雄性生殖細(xì)胞具有致突變性。然而，在Otubanjo和Mosuro[19-20]等進(jìn)行的阿苯達(dá)唑精子致畸試驗(yàn)中并未觀察到陽(yáng)性結(jié)果，同時(shí)在他們進(jìn)行的伊維菌素的精子致畸試驗(yàn)中僅觀察到精子畸形率的輕度增高，但并未明顯高于陰性對(duì)照且無(wú)劑量相關(guān)性。本次研究中，阿苯達(dá)唑和伊維菌素的劑量均高于Otubanjo和Mosuro的研究劑量，說(shuō)明了在高劑量情況下，阿苯達(dá)唑和伊維菌素均能對(duì)小鼠雄性生殖細(xì)胞產(chǎn)生毒性。從復(fù)方和單藥精子畸形率差異可知，復(fù)方誘導(dǎo)的小鼠精子畸形率明顯低于兩單藥組。由此可見(jiàn)，復(fù)方毒性相較于單藥有所降低，同時(shí)畸形種類(lèi)分布上也有較大差異，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

伊維菌素和阿苯達(dá)唑按1:24的比例形成的復(fù)方在Aems試驗(yàn)中表現(xiàn)出同單藥一樣的致突變陰性，而在小鼠骨髓微核試驗(yàn)和小鼠精子畸變?cè)囼?yàn)中卻表現(xiàn)出較單藥更低的毒性，顯示了復(fù)方的優(yōu)越性，其原因可能是伊維菌素和阿苯達(dá)唑在藥動(dòng)學(xué)上的相互作用，并且已有大量的研究表明伊維菌素和阿苯達(dá)唑聯(lián)合應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致各自藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的改變。雖然，復(fù)方阿苯達(dá)唑/伊維菌素表現(xiàn)出了較單藥更低的毒性，但是，其仍然是一種能引起小鼠骨髓微核率和精子畸變率升高的致突變陽(yáng)性藥物。鑒于其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛，需警惕該藥物的食品殘留問(wèn)題及對(duì)生態(tài)環(huán)境的危害。

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