呂鵬，吳巍，劉麗麗，張家禹，許雷，閆艷春

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081

近年來，我國從歐洲引進(jìn)了一種新型殺菌劑甲基異噻唑啉酮(methylisothiazolinone，MIT)，是異噻唑啉酮類衍生物，和其他同類衍生物相比毒性較弱[1-2]。MIT是一種高效、廣譜、藥效持久且相對(duì)安全的殺菌劑，廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，如涂料、膠水、造紙業(yè)、橡膠、感光膠片及洗滌用品等[2-5]。優(yōu)點(diǎn)是有效用量少，極易混合在各類配方中，能很好地抑制微生物的生長，因此MIT被廣泛添加進(jìn)化妝品和個(gè)人護(hù)理品制劑中，以延長保存期[1-3, 7-9]。生產(chǎn)的工業(yè)廢水、生活污水中大量MIT隨地下水循環(huán)系統(tǒng)等途徑進(jìn)入環(huán)境水體中，已有研究者在污水口和河流中檢測到了相當(dāng)量的MIT存在[8, 10-11]。盡管也有報(bào)道顯示MIT在水體中含量為ng·L-1級(jí)，且在自然環(huán)境中半衰期很短[11]，然而持續(xù)排放入水體而殘留下來的MIT是否危害水生生物的生存，影響水生生態(tài)的健康，需要進(jìn)一步研究。

文獻(xiàn)報(bào)道，MIT對(duì)黑斑蛙胚胎的96 h-LC50和半數(shù)致畸濃度(96 h-TC50)分別為5.30 mg·L-1和2.36 mg·L-1，最小生長抑制濃度(MCIG)為2.59 mg·L-1，對(duì)蝌蚪的96 h-LC50為7.58 mg·L-1 [12]，對(duì)草魚肝臟腎臟器官的細(xì)胞，在48 h后，溫度分別為15 ℃和25 ℃下的LC50范圍為0.53 mg·L-1和0.41 mg·L-1[13]，對(duì)鹵蟲無節(jié)幼體96 h-LC50為10.4 mg·L-1 [14]。還有研究表明MIT對(duì)小鼠表皮和呼吸系統(tǒng)的免疫應(yīng)答有強(qiáng)烈刺激作用，接觸2.5%的MIT處理液就能引起小鼠皮膚過敏反應(yīng)和刺激性皮膚炎[15-16]。隨著異噻唑啉酮類其他衍生物控制力度的加大，使異噻唑啉酮類物質(zhì)的危害淡出了人們的視線，且MIT對(duì)魚類毒性數(shù)據(jù)還很欠缺，所以對(duì)于水體中殘留的MIT對(duì)魚類的影響評(píng)價(jià)不足。但是MIT作為目前最廣泛使用的異噻唑啉酮類物質(zhì)，其在水中殘留和對(duì)魚類的威脅也應(yīng)該引起重視[7,9,15]。

斑馬魚作為毒理學(xué)模式動(dòng)物，具有遺傳背景清晰，體型小，產(chǎn)卵量大，胚胎發(fā)育迅速，早期透明，可清晰看到發(fā)育各階段，便于觀察和顯微操作等特點(diǎn)。斑馬魚胚胎也廣泛應(yīng)用于急性毒性實(shí)驗(yàn)中，評(píng)價(jià)各種化學(xué)物質(zhì)的毒性作用[17-20]。本研究以斑馬魚胚胎為模型，根據(jù)OECD實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(OECD Guidelines for the Testing of Chemicals)[21]，進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)MIT對(duì)斑馬魚胚胎的毒性效應(yīng)，為MIT的環(huán)境污染管控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

AB品系斑馬魚購自國家斑馬魚資源中心(China Zebrafish Resource Center, CZRC)。

儀器設(shè)備：斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(愛生科技發(fā)展有限公司，北京)；雷磁PHS-3D型pH計(jì)(精密科學(xué)儀器有限公司，上海)；電導(dǎo)度測試儀(哈納公司，意大利)；BPC-250 F型生化培養(yǎng)箱(一恒科學(xué)儀器有限公司，上海)；熒光顯微鏡X83(奧林巴斯，日本)；Heal Force超純水系統(tǒng)(力康集團(tuán)，香港)；一次性吸管和培養(yǎng)皿(康健華醫(yī)療用品有限公司，江蘇)；塑料六孔細(xì)胞培養(yǎng)板(耐思生物科技有限公司，無錫)；精密型pH試紙(sigma公司，美國)。

試劑藥品：甲基異噻唑啉酮(MIT, CAS NO: 2682-20-4; 99%，百靈威，中國)；吖啶橙(acridine orange, CAS: 10127-02-3，索萊寶，中國)；霉鏈蛋白酶(protease，CAS: 37259-58-8, Qiagen公司，德國)；三卡因甲磺酸鹽麻醉劑(tricaine methanesulfonate, TMS, CAS: 886-86-2, Sigma公司，美國)；氯化鈉、碳酸氫鈉等化學(xué)藥品均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)生物

斑馬魚的養(yǎng)殖方法：實(shí)驗(yàn)用AB品系斑馬魚在自動(dòng)水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行飼養(yǎng)，系統(tǒng)自動(dòng)維持養(yǎng)魚水的電導(dǎo)度在500～550 μS·cm-1之間，pH 為7.0～7.5，溶解氧>6.0 mg·L-1，水溫控制在(28±0.5) ℃，飼養(yǎng)環(huán)境光周期為光:暗=14 h:10 h。每天喂食新鮮豐年蟲幼蟲2～3次，幼蟲由豐年蟲卵(Aquamaster公司，中國臺(tái)灣)孵化得到。孵化時(shí)，將豐年蟲卵放于25 g·L-1氯化鈉溶液中，水溫(28±0.5) ℃，持續(xù)通氣，連續(xù)光照32 h即可孵化，收集幼蟲后去除雜質(zhì)并用清水洗去過多鹽分，可短期存放于4 ℃冰箱，或于-20 ℃下凍存[22]。

斑馬魚胚胎的收集方法：于前一天晚上將成年種魚按照雌雄比例2:2裝入交配盒中，并用隔板將雌雄魚分開。第2天早上光照開始時(shí)(10 h后)將隔板抽出，待雌雄魚追尾交配30 min后收集發(fā)育時(shí)期一致的健康胚胎[18, 24-25]。將收集到的胚胎混合均勻，換干凈的養(yǎng)魚水于培養(yǎng)皿中，作實(shí)驗(yàn)材料。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 斑馬魚胚胎毒性實(shí)驗(yàn)

為保證對(duì)照組胚胎死亡率小于5%，排除未受精及異常胚胎對(duì)毒性評(píng)價(jià)的干擾，本實(shí)驗(yàn)選擇在受精后3 h (3 hours post-fertilization，3 hpf)開始暴露染毒。收集到胚胎3 h后，去除異常和死胚，并在倒置顯微鏡下挑出正常分裂的胚胎。MIT濃度范圍根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置，將提前配制的1.0 g·L-1MIT儲(chǔ)備液用養(yǎng)魚水依次稀釋到1.52、3.71、5.43、7.12、9.48 mg·L-1，包含1個(gè)對(duì)照組，各制備500 mL處理液(避光保存)。每個(gè)處理組包含3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，20個(gè)胚胎為一個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)在6孔板中進(jìn)行，每孔加入10個(gè)健康的3 hpf胚胎，盡量去除水分之后再分別加入不同濃度的處理液10 mL，對(duì)照組加入等體積養(yǎng)魚水。采用半靜態(tài)方式進(jìn)行暴露處理，將培養(yǎng)皿置于恒溫生化培養(yǎng)箱中，暴露總時(shí)間為96 h(即從3 hpf～99 hpf)，培養(yǎng)箱孵化溫度為(28±0.5) ℃，處理液pH維持在7.0，電導(dǎo)率約510 μs·cm-1，溶氧量>6 mg·L-1，保持胚胎處理過程中光:暗=14 h:10 h。本實(shí)驗(yàn)處理?xiàng)l件比較穩(wěn)定，預(yù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)處理液監(jiān)測和高效液相色譜分析結(jié)果顯示，換水前后處理液性質(zhì)和MIT濃度保持恒定，所以采用換水式對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)[18-19, 24]，即每24小時(shí)更換一次處理液，及時(shí)挑出死亡的胚胎。每24小時(shí)對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn)行一次鏡檢觀察，測量不同時(shí)期的各項(xiàng)生理指標(biāo)和死亡、畸形等數(shù)據(jù)，進(jìn)行記錄。

1.3.2 細(xì)胞凋亡吖啶橙染色

吖啶橙染色用于檢測細(xì)胞凋亡情況，實(shí)驗(yàn)流程參照文獻(xiàn)[20, 25]。

具體方法為：選取半致死濃度1/10左右的濃度作為處理起始濃度，依次設(shè)置MIT濃度為0.5 mg·L-1、0.75 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1。處理72 h后，收集存活胚胎，用養(yǎng)魚水清洗2～3次后，對(duì)沒脫膜的胚胎使用5 mg·mL-1鏈蛋白酶在25 ℃下脫膜2 min，再用養(yǎng)魚水清洗2～3次，顯微鏡下選出存活、完整的胚胎放于培養(yǎng)皿中，以備染色。

染色方法：將提前配好的吖啶橙1 g·L-1儲(chǔ)備液用養(yǎng)魚水稀釋到2 mg·L-1，將脫膜后的胚胎轉(zhuǎn)移到2 mg·L-1的吖啶橙溶液中，避光染色30～60 min，定時(shí)觀察，當(dāng)胚胎出現(xiàn)死亡時(shí)可以終止染色。染色終止后用養(yǎng)魚水潤洗胚胎2～3次。清洗完畢后，使用0.1 g·L-1Tricaine麻醉劑處理5～10 min。待胚胎麻醉，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，所有照片拍攝條件均相同，觀察帶有黃綠色熒光標(biāo)記的凋亡細(xì)胞。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)分析

在急性毒性實(shí)驗(yàn)過程中，每24小時(shí)記錄一次胚胎死亡數(shù)，24 h時(shí)記錄胚胎自主抽動(dòng)次數(shù)，48 h后統(tǒng)計(jì)孵化胚胎數(shù)，96 h后統(tǒng)計(jì)存活的幼魚數(shù)量，以及存活胚胎的畸形數(shù)，并在顯微鏡下觀察畸形狀況，測量正常幼魚72 h時(shí)的心率、96 h體長等生理特征，并分析胚胎-幼魚運(yùn)動(dòng)、反應(yīng)等行為學(xué)特征。

毒理學(xué)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：斑馬魚胚胎的孵化從48 hpf開始，本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)處理后48 h(51 hpf)胚胎的孵化率。并以處理濃度為自變量x，胚胎孵化率為因變量y，使用SPSS 22軟件，用單因素方差分析(one-way ANOVA)法分析處理組和對(duì)照組之間孵化率差異的顯著性。采用Origin Pro 15軟件處理96 h死亡率和畸形率數(shù)據(jù)，由logistic非線性回歸分析，得到“劑量-效應(yīng)”曲線方程，計(jì)算MIT的96 h-LC50和96 h-TC50及95%的置信區(qū)間。

形態(tài)和生理特征分析：選取72 h存活的幼魚，在體視顯微鏡下統(tǒng)計(jì)胚胎心率，處理到96 h后觀察幼魚運(yùn)動(dòng)行為和應(yīng)激反應(yīng)情況，用0.1 g·L-1Tricaine麻醉劑處理5～10 min，每個(gè)處理組測量30個(gè)胚胎的體長，取平均值，使用SPSS 22中的T檢驗(yàn)分析其最小生長抑制濃度和最低毒性效應(yīng)劑量。

吖啶橙染色分析：選取不同角度，將處理組圖片與對(duì)照組進(jìn)行比對(duì)，找到凋亡細(xì)胞差異區(qū)域，排除本底熒光的干擾，分析處理組中凋亡細(xì)胞富集的范圍，從而判斷MIT的毒性作用區(qū)域。

2 結(jié)果(Results)

2.1 斑馬魚胚胎毒性實(shí)驗(yàn)

2.1.1 MIT對(duì)胚胎孵化率的影響

MIT處理液暴露48 h時(shí)，對(duì)斑馬魚胚胎的孵化率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。研究發(fā)現(xiàn)較低濃度的MIT對(duì)胚胎孵化就有抑制作用，在梯度濃度(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg·L-1)的MIT處理下，孵化率隨濃度增大而降低。對(duì)照組孵化率為31.96%，MIT濃度大于1.0 mg·L-1時(shí)，孵化率顯著下降，當(dāng)濃度大于4.0 mg·L-1后，孵化率低于15%，使用SPSS 22軟件進(jìn)行單因素方差分析((one-way ANOVA)，得到不同處理濃度下孵化率之間差異顯著性(圖1所示)。

圖1 甲基異噻唑啉酮(MIT)處理48 h后對(duì)胚胎孵化率的影響注：A. MIT不同濃度處理組胚胎孵化率，數(shù)據(jù)表示為平均值±SE(n = 3, 每個(gè)生物重復(fù)20個(gè)胚胎)，差異顯著性用星號(hào)表示， *P<0.05， ** P<0.01, *** P<0.001；B. 孵化胚胎占存活胚胎的比例。Fig. 1 Effects of methylisothiazolinone (MIT) on hatching rate after 48 h exposure Note: A. Hatching rate at different concentration of MIT， values are presented as mean ± SEM (n = 3, 20 embryos in each replicate); * P < 0.05, ** P < 0.01; *** P < 0.001; B. Percentage of hatched embryos in survival embryos.

圖2 MIT在72 h和96 h時(shí)對(duì)斑馬魚胚胎的致死率統(tǒng)計(jì)注：A. 致死率隨濃度和處理時(shí)間遞增，B. 96 h致死率logistic擬合，R2為0.9988(3個(gè)平行試驗(yàn)，n=3)。Fig. 2 Mortality of zebrafish embryos exposed to MIT after 72 h and 96 hNote: A. Mortality increased with time and concentration increasing; B. logistic nonlinear fitting of 96 h mortality, R2=0.9988 (three parallel tests, n=3).

圖3 MIT的致畸效應(yīng) 注：A為96 h發(fā)育正常的幼魚; B為體軸向內(nèi)彎曲(1)和尾部畸形(2); C為體軸向外彎曲(1)；D為心包囊腫和卵黃囊水腫；E為尾部發(fā)育不良；F為發(fā)育遲緩胚胎的畸形胚胎。Fig. 3 Teratogenesis effect of MITNote: A. normal control; B. body axon incurve (1) and tail dysmorphia (2); C. body axon outcurve (1); D. pericardial edema and yolk edema; E. tail dysontogenesis; F. embryos developmental retardation.

2.1.2 MIT對(duì)胚胎死亡率的影響

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定急性毒性實(shí)驗(yàn)MIT處理組濃度范圍為1.52～9.48 mg·L-1。48 h前未孵化胚胎的死亡率比較低，到72 h后處理組胚胎開始出現(xiàn)死亡，且隨處理濃度遞增，到96 h后，9.48 mg·L-1濃度下幼魚全部死亡。對(duì)死亡率進(jìn)行l(wèi)ogistic非線性擬合，呈S型“效應(yīng)-劑量”曲線，根據(jù)擬合方程得到96 h-LC50為6.15 mg·L-1，95%置信區(qū)間為(4.97, 7.34)，對(duì)魚類高毒，其安全濃度采用通用算法：96 h-LC50×0.01=0.06 mg·L-1(圖2所示)。

2.1.3 MIT對(duì)胚胎畸形率的影響

MIT處理96 h后，使用奧林巴斯IX 83顯微鏡觀察斑馬魚形態(tài)以及運(yùn)動(dòng)特征，統(tǒng)計(jì)孵出幼魚中畸形個(gè)體數(shù)。觀察發(fā)現(xiàn)MIT引起3種主要的畸形形態(tài)：體軸彎曲(包含尾部彎曲)、心包水腫和卵黃囊水腫(圖3所示)，3種畸形中，體軸彎曲的個(gè)體占大多數(shù)?；温孰SMIT處理濃度梯度提高而升高，在較低濃度時(shí)就有明顯的致畸效應(yīng)，1.0 mg·L-1的濃度下畸形率就達(dá)到了18.4%，可見MIT對(duì)胚胎發(fā)育有很大影響。統(tǒng)計(jì)得到96 h畸形率后，通過Origin Pro 15進(jìn)行非線性擬合分析。得到96 h-TC50為3.89 mg·L-1，95%置信區(qū)間為(2.96, 4.82)(圖4所示)。

2.1.4 MIT對(duì)斑馬魚胚胎生理特性的影響

經(jīng)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，MIT對(duì)斑馬魚生長具有抑制作用，主要體現(xiàn)在幼魚心率的降低和體長縮短。在MIT梯度濃度暴露下，72 h時(shí)不同處理組斑馬魚幼魚心率隨處理濃度提高而降低，對(duì)照組中幼魚心臟搏動(dòng)有力，平均心房率為(175±4) beats·min-1，處理濃度達(dá)到1.52 mg·L-1時(shí)，心率與對(duì)照組相比顯著下降(表3所示)。測量96 h幼魚體長數(shù)據(jù)顯示，濃度大于2.31 mg·L-1的處理組中胚幼魚長與對(duì)照組存在顯著差異，顯著性分析可判斷MIT對(duì)斑馬魚幼魚生長的最小抑制濃度(MCIG)為2.31 mg·L-1(表4所示)。

圖4 MIT對(duì)斑馬魚幼魚96 h的致畸率以及96 h致畸率logistic擬合注：A為致畸率隨濃度升高顯著增大，B為96 h時(shí)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)擬合，R2為0.9933。Fig. 4 Zebrafish embryo deformity exposed to MIT after 96 h and its logistic nonlinear fittingNote: A, Increase of deformity with the increase of MIT concentration; B, Three parallel experiments fitting, R2=0.9933.

表4 MIT 96 h暴露對(duì)斑馬魚幼魚體長的影響Table 4 Effects of MIT on the body length of zebrafish larvae after 96 h exposure

注：*表示處理組與對(duì)照組相比存在顯著差異(P<0.05)。

Note：*Indicates significant difference between exposed groups and the control group (P< 0.05)．

圖5 MIT暴露下細(xì)胞凋亡分析注：在MIT暴露72 h后，對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn)行吖啶橙染色；(A)和(B)為對(duì)照組和0.25 mg·L-1處理組，沒有凋亡細(xì)胞；(C)和(D)為1.0 mg·L-1處理組，在尾部有大量凋亡細(xì)胞存在；(E)和(F)為1.0 mg·L-1的處理組，觀察到有大量凋亡細(xì)胞存在于腦部；(G)和(H)為2.0 mg·L-1處理組，有大量凋亡細(xì)胞分布在腦部和鰓部。圖中用白色箭頭標(biāo)記凋亡細(xì)胞分布。Fig. 5 MIT-induced apoptosis analysis Note: After exposure to MIT for 72 h, the zebrafish embryos were stained with acridine orange (AO); (A) and (B), No apoptotic cells were observed in the control and 0.25 mg·L-1 MIT treated groups; (C) and (D), A large number of apoptotic cells were observed in tail in the 1.0 mg·L-1 MIT treated groups; (E) and (F), A small area of apoptotic cells were observed in the brain in the 1.0 mg·L-1 MIT treated groups; (G) and (H), In 2.0 mg·L-1 groups, a lot of apoptotic cells were observed in gill and brain. Apoptotic cells were indicated by white arrowheads.

2.2 細(xì)胞凋亡AO染色

AO染色檢測MIT暴露下胚胎細(xì)胞凋亡情況，MIT梯度暴露濃度為0.25、0.75、1.0、2.0 mg·L-1，72 h的暴露胚胎脫膜后染色，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和0.25 mg·L-1的處理組中沒有明顯的凋亡細(xì)胞群體，當(dāng)處理濃度達(dá)到1.0和2.0 mg·L-1后，能夠在高倍鏡下觀察到凋亡細(xì)胞，主要出現(xiàn)在胚胎腦部和尾部(圖5所示)。

3 討論(Discussion)

由于個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品、日用品和涂料在生活中無處不在，而且近年來一些由這些物品導(dǎo)致的過敏、疾病，使人們開始關(guān)注其中防腐劑的危害。甲基異噻唑啉酮是其中使用最廣泛的防腐劑和抗菌劑，隨著國際社會(huì)對(duì)MIT毒性的逐漸認(rèn)識(shí)，對(duì)其毒性評(píng)價(jià)也開始逐漸開展。

本文首次研究了MIT對(duì)斑馬魚胚胎的急性毒性，根據(jù)高效液相色譜分析，在實(shí)驗(yàn)條件下，72 h內(nèi)處理液中MIT濃度和性質(zhì)都能保持穩(wěn)定[6]。MIT對(duì)胚胎孵化有很強(qiáng)的抑制作用，當(dāng)濃度大于等于1.0 mg·L-1時(shí)，就能顯著抑制胚胎孵化，不能順利孵化的胚胎在96 h后全部死亡，藥物可能對(duì)胚胎早期發(fā)育相關(guān)基因或?qū)ε咛ピ缙谏泶x有影響，導(dǎo)致胚胎發(fā)育后期孵化酶分泌和活性降低而不能分解卵殼，暴露可能干擾了孵化酶的結(jié)構(gòu)和功能，具體的抑制機(jī)理有待于進(jìn)一步研究[26-27]。暴露濃度為1.52 mg·L-1時(shí)，96 h后幼魚的死亡率明顯上升，當(dāng)濃度達(dá)到9.48 mg·L-1時(shí)96 h幼魚全部死亡，得到了MIT對(duì)斑馬魚胚胎96 h的半致死濃度為6.15 mg·L-1，這對(duì)水生生物而言是高毒。暴露濃度為0.5 mg·L-1時(shí)畸形胚胎數(shù)量相比對(duì)照組顯著增多，暴露的胚胎在96 h的半致畸濃度為3.89 mg·L-1。同時(shí)，統(tǒng)計(jì)MIT暴露96 h的幼魚體長數(shù)據(jù)后，得到了最小生長抑制濃度為2.31 mg·L-1，值得注意的是，在2.31 mg·L-1的濃度下，多數(shù)胚胎都已產(chǎn)生畸形。與骨骼發(fā)育相關(guān)的畸形，如體軸彎曲占畸形比率較大，而且幼魚體長顯著變化。一方面，MIT暴露干擾了Wnt、Notch和Tgf-8等信號(hào)通路，影響胚胎靶器官的發(fā)育；另一方面可能是通過干擾發(fā)育重要基因的表達(dá)調(diào)控，如nbtps、nkx2.5和tbxl6等，進(jìn)而影響隨后的胚胎靶器官的發(fā)育，從而導(dǎo)致胚胎畸形發(fā)育[19,24]。在對(duì)胚胎生理特性和行為觀察中發(fā)現(xiàn)，暴露于1.52 mg·L-1以上濃度的MIT就能使胚胎心率顯著降低，心率降低在某種程度上也體現(xiàn)了MIT的心臟毒性[28-29]。關(guān)于斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的研究表明，24 h后胚胎神經(jīng)系統(tǒng)已經(jīng)基本發(fā)育成熟，自主抽動(dòng)次數(shù)小于等于1次[30-31]，實(shí)驗(yàn)觀察到MIT濃度大于1.52 mg·L-1的暴露組，24 h胚胎每分鐘自主抽動(dòng)次數(shù)大于1次，表明神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育受到影響。進(jìn)一步觀察72 h和96 h幼魚的行為，發(fā)現(xiàn)MIT濃度大于1.52 mg·L-1的暴露組胚胎自主活動(dòng)能力下降，且觸碰反應(yīng)遲鈍，這表明它們的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育受到了影響[31-34]。綜上所述，實(shí)驗(yàn)中大量數(shù)據(jù)和現(xiàn)象都表明，MIT對(duì)斑馬魚胚胎產(chǎn)生了比較顯著的毒性作用，包括孵化抑制、致畸性、發(fā)育抑制、心臟毒性、神經(jīng)毒性，充分說明MIT對(duì)水生物的毒害作用不容忽視，同時(shí)也為毒性機(jī)理的研究提供了依據(jù)。

本研究顯示MIT對(duì)斑馬魚胚胎具有高毒，由此看來MIT對(duì)水生生物的毒性已經(jīng)不容忽視。MIT主要通過污水排放系統(tǒng)進(jìn)入環(huán)境中，廣泛分布于地表水中，環(huán)境監(jiān)測一般水體中MIT含量通常在ng·L-1，而在污水排放口附近的河流處含量為μg·L-1[8,11]。MIT在環(huán)境中的降解主要受光照、溫度、pH、金屬離子、溶液介質(zhì)等因素的影響，有研究表明，光照、堿性、含鐵離子和強(qiáng)親核試劑，如硫化物的溶液能顯著加速異噻唑啉酮的光降解[35]。這些都導(dǎo)致了MIT的環(huán)境濃度遠(yuǎn)低于實(shí)驗(yàn)中的毒性效應(yīng)濃度，但在局部水環(huán)境中也會(huì)有過量MIT，且長期暴露于MIT污染的環(huán)境中，也可能在生物體中富集，且根據(jù)安全系數(shù)分析，長期暴露于低濃度MIT下也會(huì)對(duì)魚類產(chǎn)生不良影響[36]。

[1] Williams T. Efficacy of chloromethyl-methylisothiazolone (CMIT/MIT) biocide versus legionella and protozoa [R]. Houston: NACE International, 2007: 11-15

[2] Reinhard E, Waeber R, Niederer M, et al. Preservation of products with MCI/MI in Switzerland [J]. Contact Dermatitis, 2001, 45(5): 257-264

[3] Fewings J, Menné T. An update of the risk assessment for methylchloroisothiazolinone/methylisothiazolinone (MCI/MI) with focus on rinse-off products [J]. Contact Dermatitis, 1999, 41(1): 1-13

[4] Oono H, Hatai K, Aikawa H, et al. Effects of 2-methyl-4-isothiazolin-3-one (MT) and bronopol against fungal infection control of ayu and rainbow trout eggs and the toxicity to their fingerlings [J]. Aquaculture Science, 2008, 56(6): 559-565

[5] Rossi J C. Method for installing a flooring surface on a concrete slab or deck base coated with a sealing material: US20140360126 [P]. 2014-12-11

[6] 簡龍海, 聞宏亮, 孫健, 等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定化妝品中的甲基異噻唑啉酮和甲基氯異噻唑啉酮[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2011(11): 2652-2653

Jian L H, Wen H L, Sun J, et al. Simultaneous determination of methylisothiazolinone and chloromethylisothiazolinone in cosmetics by LC-MS/MS [J]. Chinese Journal of Health Laboratory Technology, 2011(11): 2652-2653 (in Chinese)

[7] Pascal M. 個(gè)人護(hù)理用表面活性劑的可持續(xù)發(fā)展[C]. 北京: 首屆皮膚營養(yǎng)與健康護(hù)理產(chǎn)業(yè)國際高峰論壇論文集, 2010

Pascal M. Sustainable development of surfactants for personal care [C]. Beijing: The 1stSkin Nutrition and Health Care Industry Forum, 2010 (in Chinese)

[8] Amat A M, Arques A, López-Pérez M F, et al. Effect of methylisothiazolinone on biological treatment: Efficiency of SBRs and bioindicative studies [J]. Environmental Engineering Science, 2015, 32(6): 479-485

[9] Hahn S, Schneider K, Gartiser S, et al. Consumer exposure to biocides - identification of relevant sources and evaluation of possible health effects [J]. Environmental Health, 2010, 9(1): 1-11

[10] Schwensen J F, Lundov M D, Bossi R, et al. Methylisothiazolinone and benzisothiazolinone are widely used in paint: A multicentre study of paints from five European countries [J]. Contact Dermatitis, 2015, 72(3): 127-138

[11] Rafoth A, Gabriel S, Sacher F, et al. Analysis of isothiazolinones in environmental waters by gas chromatography-mass spectrometry [J]. Journal of Chromatography A, 2007, 1164(1-2): 74-81

[12] 付旭鋒, 李圓圓, 蘇紅巧, 等. 異噻唑啉酮類殺菌劑對(duì)黑斑蛙胚胎和蝌蚪的急性毒性[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2014, 9(6): 1097-1103

Fu X F, Li Y Y, Su H Q, et al. Acute toxicity of isothiazolinone biocides toPelophylaxnigromaculatusembryos and tadpoles [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(6): 1097-1103 (in Chinese)

[13] Hu K, Li H R, Ou R J, et al. Tissue accumulation and toxicity of isothiazolinone inCtenopharyngodonidellus, (grass carp): Association with P-glycoprotein expression and location within tissues [J]. Environmental Toxicology & Pharmacology, 2014, 37(2): 529-535

[14] Seidle T, Prieto P, Bulgheroni A. Examining the regulatory value of multi-route mammalian acute systemic toxicity studies [J]. Altex, 2011, 28(2): 95-102

[15] Thyssen J P, Sederberg-Olsen N, Thomsen J F, et al. Contact dermatitis from methylisothiazolinone in a paint factory [J]. Contact Dermatitis, 2006, 54(6): 322-324

[16] Devos F C, Pollaris L, Broucke S V D, et al. Methylisothiazolinone: Dermal and respiratory immune responses in mice [J]. Toxicology Letters, 2015, 235(3): 179-188

[17] Hermsen S A B, Brandhof E J V D, Ven L T M V D, et al. Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with theirinvivo, potencies [J]. Toxicology in Vitro, 2011, 25(3): 745-753

[18] 張家禹, 劉麗麗, 李國超, 等. 毒死蜱對(duì)斑馬魚胚胎氧化應(yīng)激效應(yīng)研究[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2016, 36(3): 927-934

Zhang J Y, Liu L L, Li G C, et al. Oxidative stress effects of chlorpyrifos on zebrafish embryos [J]. China Environmental Science, 2016, 36(3): 927-934 (in Chinese)

[19] 徐永學(xué), 劉麗麗, 王健, 等. β-氯氰菊酯對(duì)斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性[J]. 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志, 2013, 27(2): 256-262

Xu Y X, Liu L L, Wang J, et al. Developmental toxicity of insecticide beta-cypermethrin on zebrafish embryos [J] Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology, 2013, 27(2): 256-262 (in Chinese)

[20] Tucker B, Lardelli M. A rapid apoptosis assay measuring relative acridine orange fluorescence in zebrafish embryos [J]. Zebrafish, 2007, 4(2): 113-116

[21] OECD. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals [R]// Methods in Molecular Biology. Paris: OECD, 2013, 947: 37-56

[22] 解相林, 劉振華, 王秀敏, 等. 溫度對(duì)鹵蟲休眠卵孵化及對(duì)無節(jié)幼蟲生長和開口的影響[J]. 河北漁業(yè), 2007(11): 32-33

Xie X L, Liu Z H, Wang X M, et al. The temperature effect on the incubation ofArtemiaparthenogeneticaeggs and the growth of the larvae [J]. Hebei Fisheries, 2007(11): 32-33 (in Chinese)

[23] Liu L, Yan Y, Wang J, et al. Generation of mt: egfp transgenic zebrafish biosensor for the detection of aquatic zinc and cadmium [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2016, 35(8): 2066-2073

[24] Yu K, Li G, Feng W, et al. Chlorpyrifos is estrogenic and alters embryonic hatching, cell proliferation and apoptosis in zebrafish [J]. Chemico-Biological Interactions, 2015, 239: 26-33

[25] 陳衍晨, 趙丹, 卿娣, 等. 缺氧再灌注斑馬魚胚胎腦部細(xì)胞凋亡及c-fos基因的表達(dá)[J]. 中國組織工程研究, 2013, 17(37): 6613-6619

Chen Y C, Zhao D, Qing D, et al. Zebrafish embryonic brain cell apoptosis and c-fos gene expression after hypoxia reperfusion [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(37): 6613-6619 (in Chinese)

[26] Cheng J, Emmanuel F, Han C S. Effect of carbon nanotubes on developing zebrafish (Daniorerio) embryos [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2007, 26(4): 708-716

[27] 劉紅云, 白偉, 張智勇, 等. 納米氧化物對(duì)斑馬魚胚胎孵化率的影響[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2009, 29(1): 53-57

Liu H Y, Bai W, Zhang Z Y, et al. Effects of several nano-oxides on the hatching rate of zebrafish embryos [J]. China Environmental Science, 2009, 29(1): 53-57 (in Chinese)

[28] 張利軍, 史慧勤, 苑曉燕, 等. 多柔比星斑馬魚胚胎心臟發(fā)育毒性表現(xiàn)[J]. 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志, 2013, 27(3): 429-433

Zhang L J, Shi H Q, Yuan X Y, et al. Cardiotoxicity of doxorubicin on embryonic zebrafish [J]. Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology, 2013, 27(3): 429-433 (in Chinese)

[29] Braun P, Schmidt S, Crouse M, et al. Triclosan Effects on Zebrafish Heart Rate [C]. Pella, IA: Proceedings of The National Conference on Undergraduate Research (NCUR), 2013

[30] Lee J, Freeman J L. Zebrafish as a model for investigating developmental lead (Pb) neurotoxicity as a risk factor in adult neurodegenerative disease: A mini-review [J]. Neurotoxicology, 2014, 43(3): 57-64

[31] Hendricks M, Jesuthasan S. Form and Function in the Zebrafish Nervous System [M]// Gong Z Y, Korzh V. Fish Development and Genetics: The Zebrafish and Medaka Models. New Jersey: World Scientfic Publish, 2015: 164-184

[32] Zhang D L, Hu C X, Li D H, et al. Zebrafish locomotor capacity and brain acetylcholinesterase activity is altered by Aphanizomenon flos-aquae, DC-1 aphantoxins [J]. Aquatic Toxicology, 2013, 138-139(8): 139-149

[33] Carmean V, Ribera A B. Genetic analysis of the touch response in zebrafish (Daniorerio) [J]. International Journal of Comparative Psychology, 2010, 23(1): 91-102

[34] 黃玉莎, 程燕, 陳小輝, 等. ?；撬釋?duì)缺氧/復(fù)氧性腦損傷斑馬魚幼魚腦組織葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78、生長停滯與DNA損傷可誘導(dǎo)蛋白34表達(dá)的影響[J]. 中華實(shí)用兒科臨床雜志, 2016, 31(6): 457-461

Huang Y S, Cheng Y, Chen X H, et al. Effect of taurine on the expression of glucose regulated protein 78 and growth arrest and DNA damage-in-ducible protein 34 in zebrafish larvae brain after hypoxia/reoxygenation brain injury [J]. Chinese Journal of Applied Clinical Pediatrics, 2016, 31(6): 457-461 (in Chinese)

[35] 張春燕, 于良民, 張志明. 異噻唑啉酮類化合物的降解及生態(tài)毒理行為研究進(jìn)展[J]. 上海涂料, 2008, 46(11): 34-36

Zhang C Y, Yu L M, Zhang Z M. Progress in the research on the degradation and the ecological toxicity behavior of isothiazolinones [J]. Shanghai Coatings, 2008, 46(11): 34-36 (in Chinese)

[36] Kovács R, Bakos K, Urbányi B, et al. Acute and sub-chronic toxicity of four cytostatic drugs in zebrafish[J]. Environmental Science and Pollution Research, 2016, 23(15): 1-12