羅瀟宇，任垠安，高浩杰，高恩光，王應(yīng)軍

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院，成都 611130

碳納米管(Carbon Nanotubes, CNTs)最先由日本NEC公司基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室的Iijima教授發(fā)現(xiàn)[1]。它是由石墨碳原子層卷曲而成的無縫、中空管體；多層石墨片卷成的稱為多壁碳納米管(Multi-walled Carbon Nanotubes, MWCNTs)；其直徑為幾納米到幾十納米，具有優(yōu)良的力學(xué)、光學(xué)、化學(xué)和電學(xué)等特性，應(yīng)用廣泛[2]。納米材料因具有較大的比表面積和獨(dú)特的催化性能而具有比相同組成的較大顆粒更大的毒性[5]。不容忽視的是，CNTs在生產(chǎn)、使用和廢棄過程中都難免會(huì)進(jìn)入環(huán)境之中，并造成一定的生態(tài)效應(yīng)和人群暴露。而進(jìn)入大氣、水和土壤的CNTs量在接下來的時(shí)間里會(huì)持續(xù)增加且在環(huán)境中難以測(cè)定其濃度[6]。CNTs釋放到水體環(huán)境中與其他污染物相互作用可以改變污染物的生物有效性和生物毒性。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度(5 μg·g-1)MWCNTs不影響Cd對(duì)銅銹環(huán)棱螺的毒性，中、高濃度Cd(25、100 μg·g-1)條件下MWCNTs顯著增加Cd的毒性[7]，意味著MWCNTs釋放到水體環(huán)境中與其他污染物相互作用可以改變污染物的生物有效性和生物毒性。功能化MWCNTs能穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，定位于胞漿中的空泡內(nèi)，造成細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量升高，導(dǎo)致細(xì)胞毒性[8-9]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)：不同劑量(2.5、5、10 mg·kg-1)羧基化多壁碳納米管(MWCNT-COOH)引起大鼠睪丸組織不同程度的損傷[9]；通過基因結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MWCNT-COOH可能主要通過影響睪丸組織MAPKs通路中的P38和JNK信號(hào)通路而對(duì)生殖產(chǎn)生影響[10]。也有研究表明MWCNTs-COOH與原始MWCNTs相比，在低濃度(12.5 mg·L-1、25 mg·L-1)時(shí)具有更好的生物相容性[11]。但至今有關(guān)其生物學(xué)效應(yīng)的機(jī)制還尚未明確，還有待進(jìn)一步研究。

藻類作為水環(huán)境中的生產(chǎn)者，在整個(gè)水生態(tài)系統(tǒng)中占重要的地位，它們的數(shù)量和種類的多樣性，直接影響整個(gè)水生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)保持生態(tài)系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定起著十分重要的作用[12]。本研究選取蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)為受試生物，它是一種普生性單細(xì)胞綠藻，直徑3～8 μm，常作為水生態(tài)毒性研究指示生物[13]。

本文通過研究MWCNTs-COOH對(duì)蛋白核小球藻葉綠素a含量、可溶性蛋白含量、總抗氧化能力(Total Antioxidant Capacity, T-AOC)及丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量等的影響，探究了MWCNTs-COOH對(duì)蛋白核小球藻的生物學(xué)效應(yīng)機(jī)制，為評(píng)估MWCNTs-COOH對(duì)微藻的生物學(xué)效應(yīng)及其環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)提供一定的數(shù)據(jù)資料和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa, FACHB-5)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院野生生物種質(zhì)庫(kù)——淡水藻種庫(kù)。在超凈臺(tái)中，將藻種轉(zhuǎn)接到滅菌之后的BG11培養(yǎng)基中，在25 ℃、光照度3 000～4 000 lux、光周期12 h Light/ 12 h Dark的光照培養(yǎng)箱(RXZ型智能人工氣候箱，寧波，江南儀器廠)中，每天定時(shí)搖瓶3次。BG11培養(yǎng)基配方如Wu等[14]在其文獻(xiàn)中所述。

MWCNTs-COOH(OD：10～20 nm, Length: 10～30 μm, 純度>98 wt%)購(gòu)自中科時(shí)代納米成都有機(jī)化學(xué)有限公司，將定量的MWCNTs-COOH分散到BG11培養(yǎng)基中，配成4 mg·L-1的母液，再滅菌待用，實(shí)驗(yàn)使用前置于超聲波清洗機(jī)(KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)，200 W、40 kHz，昆山超聲儀器有限公司)超聲30 min，使得MWCNTs-COOH分散液更為均勻。可溶性蛋白、T-AOC和MDA試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MWCNTs-COOH表征

MWCNTs-COOH結(jié)構(gòu)表征前在105 ℃烘箱中干燥24 h。熱重分析(TGA)研究材料的熱穩(wěn)定性；掃描電鏡(SEM)表征碳納米管的微觀形貌結(jié)構(gòu)。

1.2.2 藻種的活化培養(yǎng)

選取處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)，在無菌條件下轉(zhuǎn)接到BG11培養(yǎng)基中，于上述藻培養(yǎng)條件下活化1周，再進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)以滿足實(shí)驗(yàn)需求。

1.2.3 暴露實(shí)驗(yàn)

本文參照OECD 201藻類生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)方法[14]，將蛋白核小球藻接種在滅菌后的三角錐形瓶中，其初始藻接種藻密度為10×105cells·mL-1, 再加入定量MWCNTs-COOH母液，使其最終實(shí)驗(yàn)濃度為0、5、10、20、40、80 mg·L-1，暴露96 h。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 葉綠素a的測(cè)定

由于培養(yǎng)基中MWCNTs-COOH與藻細(xì)胞不易分離，本文采用葉綠素a表征藻細(xì)胞生物量，在實(shí)驗(yàn)室條件下，葉綠素a與生物量呈顯著正相關(guān)關(guān)系[15]。從0 h到96 h每天定時(shí)取5 mL藻液， 8 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，加入5 mL 90%丙酮(V/V)，搖勻，放入冰箱，4 ℃避光萃取24 h以提取蛋白核小球藻細(xì)胞中的葉綠素a[16]；把萃取過后的葉綠素a提取液置于高速離心機(jī)中，10 000 r·min-1離心10 min取上清液，以90%丙酮作為參比，置于分光光度計(jì)中分別測(cè)定上清液在波長(zhǎng)分別為630 nm、645 nm、663 nm和750 nm時(shí)的吸光度。采用文獻(xiàn)[17]的方法計(jì)算：

C(μg·mL-1)=11.64×(A663-A750)-2.16×(A645-A750)+0.10×(A630-A750)

1.2.5 可溶性蛋白含量、T-AOC和MDA含量的測(cè)定

在實(shí)驗(yàn)96 h時(shí)分別取每個(gè)錐形瓶中藻液40 mL，4 500 r·min-1離心10 min，棄上清液，用5 mL生理鹽水懸浮洗滌2～3次以除去附著在蛋白核小球藻表面的培養(yǎng)基，再離心，之后就可得到藻細(xì)胞。然后把藻細(xì)胞轉(zhuǎn)移至研缽中，加入2 mL預(yù)冷的生理鹽水和少量的石英砂進(jìn)行冰浴研磨，直到鏡檢無完整藻細(xì)胞為止，定容到10 mL，4 ℃下5 000 r·min-1離心10 min，上清液即為樣本提取粗酶液。可溶性蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[18]，MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法(TBA法)[18]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及t檢驗(yàn)，P<0.05表示有顯著性差異，用*表示。采用Origin進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果(Results)

2.1 MWCNTs-COOH表征

圖1 多壁碳納米管(MWCNTs)表征譜圖Fig. 1 The characterization spectra of multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs)

廠家提供的原始多壁碳納米管TGA、SEM表征圖分別如圖1-a和圖1-b所示，MWCNTs-COOH 的TGA、SEM圖分別如圖1-c和圖1-d所示。對(duì)比可知，MWCNTs-COOH碳管被截短，管身發(fā)生斷裂，端口被打開，表面變得光滑平整，分散性提高，部分碳管管徑明顯變粗。

2.2 MWCNTs-COOH對(duì)C. pyrenoidosa葉綠素a含量的影響

圖2顯示了在不同MWCNTs-COOH濃度條件下，C.pyrenoidosa葉綠素a含量的變化情況，選取濃度為0 mg·L-1的實(shí)驗(yàn)組為對(duì)照組。在低濃度條件下(5 mg·L-1)，C.pyrenoidosa的葉綠素a含量呈逐日上升趨勢(shì)，與空白組差異不顯著(P>0.05)。在中、高濃度(10, 20 mg·L-1)條件下，24 h葉綠素a含量低于中高濃度組初始含量，之后又恢復(fù)逐日增長(zhǎng)的趨勢(shì)，尤其是20 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組在暴露72 h時(shí)取得最大值1.024 μg·mL-1，與其他組相比差異顯著(P<0.05)。而在高濃度(40, 80 mg·L-1)暴露下，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組葉綠素a含量均呈先降低后升高再降低的趨勢(shì)，且24 h后與對(duì)照組葉綠素a含量差異顯著(P<0.05)。以上現(xiàn)象表明，5 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組C.pyrenoidosa生長(zhǎng)未受到明顯影響(P>0.05)；10、20 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組C.pyrenoidosa在初期受到實(shí)驗(yàn)材料一定影響，但很快就恢復(fù)良好的生長(zhǎng)狀態(tài)；而40、80 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組的C.pyrenoidosa隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，生長(zhǎng)受到明顯抑制(P<0.05)。

圖2 不同濃度MWCNTs-COOH對(duì)蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)葉綠素a含量的影響注：*表示與對(duì)照組有顯著差異，P<0.05。Fig. 2 Effect of MWCNTs-COOH on the chlorophylla content in C. pyrenoidosaNote: * indicates a significant difference from the control group, P <0.05.

2.3 MWCNTs-COOH對(duì)C. pyrenoidosa可溶性蛋白含量的影響

圖3揭示了不同濃度MWCNTs-COOH對(duì)C.pyrenoidosa暴露96 h后，C.pyrenoidosa的可溶性蛋白含量變化。由圖3可知C.pyrenoidosa中的可溶性蛋白含量隨MWCNTs-COOH暴露濃度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。20 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組取得最大可溶性蛋白含量為0.051 g ·L-1, 與對(duì)照組比較，40、80 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組可溶性蛋白含量明顯下降(P<0.05)。

圖3 不同濃度MWCNTs-COOH對(duì)蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)可溶性蛋白含量的影響注：*表示與對(duì)照組有顯著差異，P<0.05。Fig. 3 Effect of MWCNTs-COOH on the soluble protein content in C. pyrenoidosaNote: * indicates a significant difference from the control group, P <0.05.

2.4 總抗氧化能力(T-AOC)對(duì)MWCNTs-COOH脅迫的響應(yīng)

圖4顯示了C.pyrenoidosa在不同濃度MWCNTs-COOH暴露96 h后，機(jī)體抗氧化能力的高低。C.pyrenoidosa的T-AOC值隨著MWCNTs-COOH脅迫濃度的增加，呈降低趨勢(shì)。在低濃度條件下(5 mg·L-1)，C.pyrenoidosa的T-AOC值變化不明顯(P>0.05)，表明C.pyrenoidosa對(duì)低濃度的MWCNTs-COOH表現(xiàn)出一定的耐性；在中、高濃度(10, 20 mg·L-1)條件下實(shí)驗(yàn)組的T-AOC值低于對(duì)照組(P>0.05)，表明C.pyrenoidosa的抗氧化能力受到一定程度破壞，機(jī)體健康狀態(tài)可能進(jìn)一步惡化；40、80 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組T-AOC值明顯降低(P<0.05)，表明C.pyrenoidosa的抗氧化能力已經(jīng)遭到破壞，40、80 mg·L-1的MWCNTs-COOH處理對(duì)C.pyrenoidosa造成了氧化損傷。

圖4 不同濃度MWCNTs-COOH對(duì)蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)T-AOC的影響注：*表示與對(duì)照組有顯著差異，P<0.05。Fig. 4 Effect of MWCNTs-COOH on the T-AOC in C. pyrenoidosaNote: * indicates a significant difference from the control group, P <0.05.

2.5 MWCNTs-COOH脅迫下C. pyrenoidosa中MDA含量的變化

圖5顯示了在不同濃度MWCNTs-COOH脅迫下C.pyrenoidosa中MDA含量變化情況。與對(duì)照組相比，低濃度(5 mg·L-1)實(shí)驗(yàn)組MDA含量變化不明顯(P>0.05)，中高濃度(10, 20 mg·L-1)及更高濃度實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞MDA含量明顯升高(P<0.05)?？傮w上，C.pyrenoidosa中MDA含量隨著MWCNTs-COOH濃度的升高而增加，其中藻細(xì)胞MDA含量最大值12.84 nmol·mg-1prot在80 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組取得，表明隨著MWCNTs-COOH濃度的升高，C.pyrenoidosa受到的氧化脅迫變大，膜脂質(zhì)過氧化作用加劇，藻細(xì)胞損傷愈加嚴(yán)重。

圖5 不同濃度MWCNTs-COOH對(duì)蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)MDA含量的影響注：*表示與對(duì)照組有顯著差異，P<0.05。Fig. 5 Effect of MWCNTs-COOH on the content of MDA in C. pyrenoidosaNote: * indicates a significant difference from the control group, P<0.05.

3 討論(Discussion)

目前，碳納米管的實(shí)際環(huán)境濃度還不清楚，但這并不影響研究者們對(duì)其環(huán)境毒性效應(yīng)研究的關(guān)注[19-20]。葉綠素a存在于所有綠色植物中，是葉綠素的重要組成成分，能夠吸收和轉(zhuǎn)換光能；同時(shí)，實(shí)驗(yàn)條件下的藻類葉綠素a與生物量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。在本實(shí)驗(yàn)中，葉綠素a含量既代表了C.pyrenoidosa生物量的高低，又能在一定程度上反映藻細(xì)胞在受到脅迫時(shí)進(jìn)行光合作用能力的強(qiáng)弱；在高濃度(≥40 mg·L-1)條件下，實(shí)驗(yàn)組葉綠素a含量均呈先降低后升高再降低的趨勢(shì)，可能是由于在實(shí)驗(yàn)開始，由高濃度MWCNTs-COOH引起的遮蔽效應(yīng)大于劑量效應(yīng)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，當(dāng)MWCNTs-COOH在實(shí)驗(yàn)組藻液中分散趨于穩(wěn)定后，劑量效應(yīng)占主要地位，C.pyrenoidosa生長(zhǎng)受到抑制，藻細(xì)胞內(nèi)的葉綠素酸酯還原酶合成受到抑制，影響了氨基-r-酮戊酸的合成，從而使葉綠素a含量降低[21]。這與龍志峰[22]的研究結(jié)果類似。蛋白質(zhì)是生物體和酶蛋白的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)生物體的代謝活性有很大影響[23]。暴露96 h后，中、高濃度(10、20 mg·L-1)反而刺激C.pyrenoidosa細(xì)胞可溶性蛋白的合成，可能是由于隨著MWCNTs-COOH濃度的升高，胞內(nèi)開始積累ROS，C.pyrenoidosa細(xì)胞為應(yīng)對(duì)這種環(huán)境脅迫和維持胞內(nèi)ROS平衡，抗氧化系統(tǒng)介入，通過合成更多抗氧化酶來抵御脅迫，使細(xì)胞免受或減緩環(huán)境脅迫對(duì)其的破壞，而胞內(nèi)抗氧化酶均屬于可溶性蛋白[23]。暴露在高濃度(≥40 mg·L-1)，MWCNTs-COOH對(duì)C.pyrenoidosa表現(xiàn)出毒性效應(yīng)；細(xì)胞自身的抗氧化系統(tǒng)已不足以抵御由于MWCNTs-COOH濃度上升導(dǎo)致的環(huán)境脅迫，細(xì)胞活性降低；同時(shí)，進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)的MWCNTs-COOH會(huì)增強(qiáng)蛋白質(zhì)水解酶的活性，加快蛋白質(zhì)水解，表現(xiàn)為可溶性蛋白含量減少[24]。機(jī)體防御體系的抗氧化能力的強(qiáng)弱與健康程度存在著密切的聯(lián)系，該防御體系有酶促與非酶促2個(gè)體系，體系各成分之間相互起到協(xié)同作用，以及代償作用與依賴作用。T-AOC越強(qiáng)說明機(jī)體受脅迫能力越強(qiáng)，機(jī)體健康狀態(tài)良好；反之，機(jī)體受脅迫能力越弱，健康狀態(tài)不佳。在中高濃度以下(≤20 mg·L-1)，由于C.pyrenoidosa細(xì)胞未受脅迫或通過自身抗氧化系統(tǒng)抵御環(huán)境脅迫，其健康狀態(tài)良好，故其T-AOC值維持在一個(gè)較高水平；而高濃度(≥40 mg·L-1)條件下，細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)不足以抵御環(huán)境脅迫或遭到破壞，細(xì)胞健康狀態(tài)惡化，MWCNTs-COOH濃度越高，C.pyrenoidosa細(xì)胞T-AOC值越小，細(xì)胞活性降低，出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。機(jī)體受到環(huán)境脅迫時(shí)會(huì)通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基(ROS)，后者能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過氧化物。丙二醛(MDA)作為脂質(zhì)過氧化物之一，其含量的高低間接反映了機(jī)體受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[25]。當(dāng)細(xì)胞T-AOC降低，藻細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)會(huì)發(fā)生紊亂，ROS的生產(chǎn)和清除平衡被打破，使得ROS在藻細(xì)胞中累積加劇，導(dǎo)致藻細(xì)胞受到膜脂過氧化的傷害，MDA含量迅速增加；同時(shí)，MDA也會(huì)反過來抑制和降低抗氧化酶的活性和含量。

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