燕 杰，蔣 琪

(天津醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校， 天津 300222)

在全球范圍內(nèi)，肺癌是發(fā)病率和病死率增長(zhǎng)最快、對(duì)人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，肺癌分別占男性和女性癌癥的17%和9%[1]，造成了約19%的癌相關(guān)死亡。深入了解肺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)，對(duì)于肺癌的早期發(fā)現(xiàn)和診斷以及提高治療效果有著非常重要的意義。有報(bào)道，孕激素和脂聯(lián)素分子受體3(progestin and adipoQ receptor 3，PAQR3)在前列腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌和胃癌等多種腫瘤中表達(dá)降低[2- 3]，而且在腫瘤形成、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮了抑制作用。但是，關(guān)于PAQR3在肺癌中的相關(guān)研究還比較少。因此，本文對(duì)肺癌組織中PAQR3的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)和分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例:選取40例不同年齡、不同性別已經(jīng)接受過外科手術(shù)，但未接受過任何放療和化療的肺癌患者的肺癌組織和癌旁組織石蠟標(biāo)本，收集標(biāo)本時(shí)間為2015-2016年，其中男26例，女14例；年齡42～78歲，平均年齡55.6歲。

1.1.2 試劑:PAQR3和β-actin引物(上海生工生物工程股份有限公司)，總RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒(Thermo Scientific公司)，UltraSYBR Mixture(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，PAQR3抗體(Abcam公司)，β-actin抗體和二抗(博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 Real-time RT-PCR檢測(cè)PAQR3 mRNA表達(dá):取50 mg組織，在研缽中研磨，研磨期間不斷加入液氮，隨后提取總RNA，NanoDrop2000測(cè)定RNA濃度及A260/A280比值(1.8～2.0)后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。設(shè)計(jì)real-time RT-PCR引物，并通過NCBI blast檢測(cè)其特異性。PAQR3引物：5′-AACCCGTACAT CACCGACG-3′(F)，5′-TCTGGACGCACTTGCTGAAG-3′(R)；β-肌動(dòng)蛋白(β-Actin)引物：5′-CATGTACGTTGCTATC CAGGC-3′(F)，5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′(R)。反應(yīng)體系50 μL：2×UltraSYBR Mixture 25 μL，模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，雙蒸水21 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s。

1.2.2 Western blot檢測(cè)PAQR3蛋白表達(dá):取50 mg組織，勻漿后提取總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，取等量蛋白采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，4 ℃孵育一抗過夜，洗去一抗以辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，洗滌后使用Tanon 5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)曝光成像，分析結(jié)果，β-actin作為內(nèi)參。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì):采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。配對(duì)的肺癌和癌旁組織樣本的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及GSE18842芯片數(shù)據(jù)通過配對(duì)樣本的t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組織中PAQR3 mRNA的表達(dá)情況:40例樣本中有36例(90%)肺癌組織中PAQR3 mRNA的表達(dá)水平降低，明顯低于對(duì)照組(8.53±0.96 vs 10.28±1.61)(P<0.001)。

2.2 肺癌組織中PAQR3蛋白的表達(dá)情況:與癌旁組織相比，肺癌組織中PAQR3蛋白的表達(dá)水平降低(P<0.01)(圖1)。

2.3 GEO數(shù)據(jù)分析:在NCBI GEO數(shù)據(jù)庫芯片GSE18842中包含44個(gè)配對(duì)的非小細(xì)胞肺癌與癌旁組織，在癌組織中PAQR3基因mRNA的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(3.39±0.13 vs 3.47±0.17)(P<0.05)。

3 討論

PAQR3是孕酮和脂聯(lián)素受體(PAQR)家族中的一員，人PAQR3基因定位于染色體4q21.21，其編碼的蛋白分子質(zhì)量大小約37 ku。PAQR3被報(bào)道可以將細(xì)胞質(zhì)中的Raf- 1錨定至高爾基體， 阻斷EGF刺激的Raf- 1膜轉(zhuǎn)位， 降低Raf- 1與Ras和MEK1的相互作用，對(duì)Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的活化起到了阻斷的作用，從而抑制肝癌的生長(zhǎng)。

N.cancer ajacent tissues; T.cancer tissues; *P<0.01 compared with cancer ajacent tissues圖1 PAQR3在肺癌組織及癌旁組織中的蛋白表達(dá)水平Fig 1 The expression level of PAQR3 protein in lung cancer tissues and adjacent normal tissues(±s, n=3)

本研究發(fā)現(xiàn)，PAQR3在肺癌組織中的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯低于癌旁組織，PAQR3的低表達(dá)可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了一定的作用。研究報(bào)道[4]，DNA損傷結(jié)合蛋白2(damage-specific DNA-binding protein 2，DDB2)可能參與了PAQR3的泛素化和降解，這可能是PAQR3表達(dá)降低的機(jī)制之一。

總之，PAQR3在肺癌組織中呈明顯低表達(dá)，但其表達(dá)水平降低和發(fā)揮作用的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究，來為闡明肺癌的發(fā)生發(fā)展規(guī)律提供幫助，為肺癌的診斷和治療提供新的思路。

[1] Torre LA, Bray F, Siegel RL,etal. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65: 87- 108.

[2] Qiao S, Guo W, Liao L,etal. DDB2 is involved in ubiquitination and degradation of PAQR3 and regulates tumorigenesis of gastric cancer cells[J]. Biochem J, 2015,469: 469- 480.

[3] Li RH, Zhang AM, Li S,etal. PAQR3 gene expression and its methylation level in colorectal cancer tissues[J]. Oncol Lett,2016,12: 1773- 1778.

[4] Guo W, You X, Xu D,etal. PAQR3 enhances Twist1 degradation to suppress epithelial-mesenchymal transition and metastasis of gastric cancer cells[J]. Carcinogenesis,2016,37: 397- 407.