安方玉，顏春魯,2*，劉永琦，伍志偉，蘇 韞，牛彥強，柳鵬瑤

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 1.教學(xué)實驗實訓(xùn)中心；2.甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級重點實驗室；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；4.臨床醫(yī)學(xué)院；5.中醫(yī)臨床學(xué)院，甘肅 蘭州730000)

鎘(cadmium，Cd)是一種毒性大、蓄積性強的重金屬毒物[1]。當(dāng)攝入量逐漸增加時，可引起機體多臟器產(chǎn)生不同程度的損害作用[2]。長期低劑量的鎘攝暴露可造成肝臟不同程度的氧化應(yīng)激損傷，會引起肝發(fā)生炎性反應(yīng)、水腫和出血等病理改變[3]。黃芪具有保肝、利尿、抗衰老和抗應(yīng)激等藥理作用[4]。但對其慢性鎘中毒大鼠肝臟損傷的保護作用尚不明確。本研究以大鼠慢性鎘中毒模型為對象，觀察黃芪多糖對氯化鎘所致大鼠肝臟損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級Wistar大鼠36只，體質(zhì)量(180±20)g，雌雄各半[甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心提供，實驗動物質(zhì)量合格證編號：SCXK(甘)2011- 0001- 0001344]。

1.1.2 試劑：氯化鎘(天津市巴斯夫化工有限公司)；羧甲基纖維素鈉 (天津市大茂化學(xué)試劑廠)；考馬斯亮蘭試劑盒和AST、ALT及LDH檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Rat IL- 2 precocated ELISA kit 和Rat TGF-β precocated ELISA kit檢測試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)；Bax和Bcl- 2抗體(ImmunoWay Biotechnology公司)；藥材選用甘肅地道藥材黃芪，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心藥物制劑實驗室提取、分離、鑒定(純度達到50%以上)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理：將大鼠隨機分為3組：對照組、模型組(腹腔注射0.1%氯化鎘，1.5 mg/kg相當(dāng)于1.5 mL/kg，5次/周，共5周)、黃芪多糖干預(yù)組(給予黃芪多糖20 mg/kg灌胃治療，1次/d，連續(xù)5周)，每組12只。末次給藥后，取肝臟備用。

1.2.2 大鼠肝指數(shù)測定的結(jié)果：末次給藥24 h后，稱量大鼠體質(zhì)量，股動脈采血處死大鼠。摘取大鼠的肝臟稱重并計算肝指數(shù)。肝指數(shù)=肝臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.2.3 大鼠肝組織細胞因子測定結(jié)果：按照ELISA試劑盒說明書測定大鼠肝組織白細胞介素- 2(IL- 2)及轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)的含量。肝勻漿液的制備采用1:10比例。

1.2.4 大鼠肝組織酶活性和Cd含量測定結(jié)果：均嚴格按照試劑盒說明測定肝組織谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)活性、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)活性和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性，鎘(Cd)含量。肝勻漿液制備同1.2.3。

1.2.5 大鼠肝組織Bcl- 2和Bax蛋白表達的測定：采用SP法，加入Bax和Bcl- 2抗體(1∶300，1∶400)，4 ℃孵育過夜。次日，加入相應(yīng)生物素標記的二抗(1∶100)孵育，最后經(jīng)DAB 顯色、質(zhì)染。以染色呈棕黃色或棕褐色顆粒表達為陽性結(jié)果。400倍鏡下每張切片隨機選取5個視野，每視野選5個陽性區(qū)域進行平均吸光度值測量，表達強弱與吸光度值呈反比。

1.2.6 大鼠血清酶活性測定結(jié)果：按照試劑盒說明書測定血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性和乳酸脫氫酶(LDH)活性。 血清的制備采用股動脈采血和靜置，離心的方法獲得。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝指數(shù)的測定結(jié)果

與對照組比較，模型組大鼠肝臟指數(shù)顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，黃芪多糖干預(yù)組大鼠肝臟指數(shù)明顯回降(P<0.05)(表1)。

表1 各組動物肝臟指數(shù)結(jié)果比較

#P<0.05 compared with control；*P<0.05 compared with model.

2.2 大鼠肝組織細胞因子含量測定結(jié)果

與對照組比較，模型組大鼠肝組織IL- 2含量顯著降低，TGF-β1含量顯著升高(P<0.01)；與模型比較，黃芪多糖干預(yù)組大鼠肝組織IL- 2含量回升，TGF-β1含量顯著回降(P<0.01)(表2)。

表2 各組動物肝組織IL- 2和TGF-β1含量比較

#P<0.01 compared with control；*P<0.01 compared with model.

2.3 大鼠肝組織酶活性和Cd含量測定結(jié)果

與對照組比較，模型組大鼠肝組織AST、ALT與LDH活性和Cd含量均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，黃芪多糖干預(yù)組大鼠肝組織AST、ALT與LDH活性和Cd含量均顯著回降(P<0.01)(表3)。

表3 各組動物肝組織AST、ALT及LDH的活性和Cd含量比較

#P<0.01 compared with control；*P<0.01 compared with model.

2.4 大鼠肝組織Bcl- 2活性和Bax蛋白表達結(jié)果

Bcl- 2和Bax在正常機體的表達主要在肝細胞的胞質(zhì)中表達。與對照組比較，鎘染毒模型組大鼠肝組織中Bcl- 2表達下降，Bax表達升高(P<0.05)。與模型組比較，黃芪多糖干預(yù)組大鼠肝組織Bcl- 2表達回升，Bax表達回落(P<0.05)(表4,圖1)。

表4 各組動物肝組織Bcl- 2和Bax蛋白表達吸光度值比較

*P<0.05，**P<0.01 compared with model；#P<0.01 compared with control.

2.5 大鼠血清酶活性測定結(jié)果

與對照組比較，模型組大鼠血清AST、ALT、LDH活性均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，黃芪多糖干預(yù)組大鼠血清AST、ALT、LDH活性均顯著回降(P<0.05)(表5)。

A.control; B.model; C.astragalus polysaccharides intervention圖1 各組大鼠肝組織Bcl- 2和Bax蛋白表達Fig 1 Protein expressin of Bcl- 2 and Bax in liver tissue of each group rats(IHC-P，×400)

groupASTALTLDHcontrol120±1832.71±5.43930±79model162±20#75.33±7.28#1537±84#Astragaluspolysaccharidesintervention131±16** 44.02±6.81** 1281±114*

*P<0.05，**P<0.01 compared with model；#P<0.01 compared with control.

3 討論

鎘攝入過量可在機體包括肝等多種組織器官中沉積。其毒性作用可能是蓄積在肝中的鎘一方面使肝細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生大量自由基，進一步加重膜結(jié)構(gòu)的破壞，從而加重鎘對肝組織的損害[5]；另一方面鎘會使肝細胞通透性發(fā)生改變，肝組織AST和ALT可隨染鎘劑量的增加和時間的延長急劇升高，因此，肝臟AST和ALT活性增強是反映肝損傷最敏感的指標[6]；最后，大量鎘攝入機體會導(dǎo)致機體發(fā)生代謝紊亂，導(dǎo)致某些酶活性發(fā)生改變。此外，細胞因子在鎘毒中主要參與免疫調(diào)節(jié)和炎性反應(yīng)。其中，IL- 2通過和IL- 2R作用，參與調(diào)節(jié)機體的細胞免疫、體液免疫和NK細胞的殺傷活性[7]。TGF-β1 主要參與調(diào)節(jié)免疫、誘導(dǎo)細胞分化、促進ECM形成等多種生理功能[8]。

近年來，Bcl- 2家族在鎘毒中的作用也逐漸被關(guān)注，Bcl- 2和Bax是一對調(diào)控細胞凋亡的關(guān)鍵基因[9]。Bcl- 2為抑制細胞凋亡的基因，而Bax是一個能夠促進細胞凋亡的基因[10]。因此，Bcl- 2的表達升高和Bax的表達降低，有利于細胞的存活。有研究發(fā)現(xiàn)，急慢性鎘暴露可影響細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡[11- 12]。本實驗表明，大鼠腹腔注射氯化鎘后，其肝及血清中ALT、AST及LDH活性均增強，并且肝組織Cd含量、TGF-β1含量和Bax的蛋白表達均升高，而肝組織IL- 2含量和Bcl- 2的蛋白表達均降低，說明鎘可以引發(fā)大鼠肝的氧化應(yīng)激損傷、免疫功能受損或可能發(fā)生纖維化；而黃芪多糖干預(yù)組可明顯降低肝及血清中上述酶的活性、可明顯升高肝組織IL- 2含量和Bcl- 2的蛋白表達，降低肝組織TGF-β1含量和Bax的蛋白表達，提示其對肝臟的保護作用是通過調(diào)節(jié)酶活性、免疫功能和Bcl- 2/Bax的蛋白表達來完成的。

總之，黃芪對鎘染毒大鼠肝損傷具有保護作用，其機制可能是通過調(diào)節(jié)Bcl- 2/Bax的蛋白表達，間接實現(xiàn)對肝組織細胞因子及酶活性的調(diào)控作用，從而減緩鎘在肝組織的沉積，進而促進鎘在機體的重新分布，但黃芪對鎘中毒的干預(yù)機制尚需進一步深入探究。

[1] Anetor JI. Rising environmental cadmium levels in developing countries: threat to genome stability and health [J]. Niger J Physiol Sci,2012,27:103- 115.

[2] Usuda K, Kono K, Ohnishi K,etal. Toxicological aspects of cadmium and occupational health activities to prevent workplace exposure in Japan: A narrative review [J].Toxicol Ind Health,2011,27:225- 233.

[3] 余日安, 陳學(xué)敏. 硒對鎘誘導(dǎo)的在體大鼠肝細胞 DNA損傷、細胞凋亡和細胞增殖的影響[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2004,38:155- 158.

[4] 萇沛森, 王輝, 劉珮, 等. 黃芪藥性功用考證[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2017,19:163- 165.

[5] Jomova K, Valko M. Advances in metal-induced oxidative stress and human disease[J]. Toxicology,2011,283:65- 87.

[6] 王昆, 潘菲, 李琳玉, 等. 甘草酸2種差向異構(gòu)體對鎘染毒小鼠肝損傷保護作用研究[J].中國職業(yè)醫(yī)學(xué), 2015,42:195- 198.

[7] 梁瑩, 黃盼柳, 樊曉暉, 等. 新城疫病毒 7793 對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型小鼠肝內(nèi)Th1、Th2、Th17類細胞因子表達的影響[J].腫瘤學(xué)雜志, 2016,22:355- 359.

[8] 張家富, 姜輝, 高家榮, 等. 肝樂顆粒對肝纖維化大鼠TGF-β1/Smad信號通路的調(diào)控作用[J].中國實驗方劑學(xué)雜志, 2017,23:169- 174.

[9] 柳承希, 詹杰, 劉志梅, 等. 冠心康顆粒劑對鎘致血管內(nèi)皮細胞凋亡影響的研究[J].實用中醫(yī)內(nèi)科雜志,2011,25:3- 6.

[10] 楊洋博君, 王爽, 李舒, 等. 復(fù)方大七氣湯聯(lián)合順鉑對裸鼠卵巢癌皮下移植瘤 Bcl- 2/Bax表達的影響[J].中國中藥雜志,2015,40:1575- 1579.

[11] Thévenod F, Lee WK. Cadmium and cellular signaling cascades: interactions between cell death and survival pathways [J]. Arch Toxicol,2013,87:1743- 1786.

[12] Liu W, Zhao H, Wang Y,etal. Calcium-calmodulin signaling elicits mitochondrial dysfunction and the release of cytochrome c during cadmium-induced apoptosis in primary osteoblasts [J].Toxicol Lett,2014,224:1- 6.