張玄，李霄，王權(quán)成，張虹，白鴿，陶開(kāi)山，竇科峰（空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院肝膽外科，全軍器官移植研究所，陜西 西安 710032）

異種器官移植是未來(lái)解決同種器官短缺的有效途徑之一，而豬被認(rèn)為是最佳異種器官供體。隨著α-1，3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶敲除（α-1，3-galactosyltransferase gene knockout，GTKO）豬的逐漸人源化改造，以及新型共刺激信號(hào)阻斷劑進(jìn)入臨床前試驗(yàn)階段，異種移植的免疫學(xué)屏障正不斷被攻克，臨床異種器官移植已經(jīng)離我們?cè)絹?lái)越近。

與心臟、腎臟移植相比，異種肝移植不僅存在免疫排斥反應(yīng)，更為嚴(yán)重的是受體凝血功能調(diào)節(jié)障礙，約90%的受體會(huì)出現(xiàn)血循環(huán)中血小板急劇減少，引發(fā)致死性出血。因此，受體的存活時(shí)間十分有限（目前的記錄為29天［1］），遠(yuǎn)遠(yuǎn)無(wú)法滿足臨床需求。這和肝臟本身生理功能復(fù)雜，有嚴(yán)重的“生理不兼容”等問(wèn)題有關(guān)。本文將針對(duì)異種肝移植中存在的凝血調(diào)節(jié)障礙，圍繞移植過(guò)程中出現(xiàn)的血小板激活、聚集和吞噬等免疫生物學(xué)問(wèn)題，特別是血小板和肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞及庫(kù)普弗（Kupffer）細(xì)胞之間的相互作用進(jìn)行論述。

1 豬-猴肝移植時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重的凝血功能紊亂

最早報(bào)道豬-非人靈長(zhǎng)類異種肝移植術(shù)后會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重血小板減少和不可控制出血現(xiàn)象的是Calne教授團(tuán)隊(duì)［2］。研究顯示，這類凝血障礙并不是獨(dú)立出現(xiàn)的，往往伴隨著超急性排斥反應(yīng)（hyperacute rejection，HAR）的發(fā)生，這可能與移植中普遍使用野生型豬的肝臟有關(guān)。移植肝臟免疫組織化學(xué)會(huì)有明顯的IgG、IgM、C3、C4d和C5b-9沉積，同時(shí)可觀察到血小板嚴(yán)重減少，急性出血性凝固性壞死、可能的梗死和纖維蛋白血栓［3］。2000年，Ramírez等［4］使 用 轉(zhuǎn) 人 CD55分 子（decay accelerating factor，DAF）的基因修飾豬進(jìn)行異種肝移植后，2只狒狒分別活了4天和8天。2例移植肝臟均未觀察到明顯的HAR發(fā)生，但在術(shù)后第1天即發(fā)生血小板嚴(yán)重丟失，同時(shí)伴有顯著纖維蛋白原減少和D-二聚體升高，提示出現(xiàn)消耗性凝血功能障礙。在后續(xù)轉(zhuǎn)入人CD59分子和H-transferase后也得到類似結(jié)果，受體存活時(shí)間均小于24小時(shí)［5］。

2012年，匹茲堡的研究團(tuán)隊(duì)率先進(jìn)行了GTKO豬-狒狒異種肝移植嘗試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GTKO或GTKO/hCD46豬肝臟配合臨床級(jí)別的免疫抑制治療，受體的存活時(shí)間可延長(zhǎng)到7天，但仍會(huì)死于嚴(yán)重的血小板減少導(dǎo)致的多組織、器官的自發(fā)性出血［3，6］。研究顯示，血小板減少一般發(fā)生在肝移植術(shù)后1小時(shí)，有報(bào)道稱狗-豬異種肝移植術(shù)后15分鐘即可觀察到血小板減少［7］，但移植肝功能相對(duì)正常，可檢測(cè)到豬源凝血因子和白蛋白的表達(dá)［8］。組織活檢未發(fā)現(xiàn)有明顯的HAR或急性體液、細(xì)胞性排斥反應(yīng)的發(fā)生。免疫組化提示移植肝中有輕度的IgM沉積，未見(jiàn)IgG、C3、C4d及C5b-9沉積和T、B淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。共聚焦顯微鏡和電鏡證實(shí)移植肝血竇有大量血小板聚集、血小板-纖維蛋白混合血栓形成及單核/巨噬細(xì)胞邊緣浸潤(rùn)現(xiàn)象［3］。

有學(xué)者加強(qiáng)了GTKO豬-狒狒肝移植中免疫抑制治療，可延長(zhǎng)受體存活時(shí)間到9天。此例實(shí)驗(yàn)中，氨基己酸（賴氨酸的衍生物和類似物，賴氨酸質(zhì)粒結(jié)合位點(diǎn)的有效抑制劑，從而阻斷纖維蛋白溶解）的使用大大緩解了血小板丟失。雖然血小板的減少臨近界值（血小板計(jì)數(shù)維持在40 000～50 000/mm3），狒狒仍出現(xiàn)嚴(yán)重的出血現(xiàn)象，并最終死于膿毒血癥［9］。

2013年，空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院竇科峰教授團(tuán)隊(duì)在國(guó)際上首次嘗試了GTKO豬-藏酋猴脾窩輔助性肝移植研究。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，受體的脾臟被切除，部分供體肝臟（約120 g）被植入脾窩，術(shù)后受體存活時(shí)間延長(zhǎng)至14天。組織學(xué)染色證實(shí)移植肝中有一定程度的血栓性微血管病（thrombotic microangiopathy，TMA）形成，但術(shù)后嚴(yán)重血小板丟失現(xiàn)象并未出現(xiàn)，其計(jì)數(shù)始終維持在50 000/mm3以上的水平。

2 豬-猴肝移植凝血功能紊亂病理特征

豬-猴肝移植時(shí)受體的凝血系統(tǒng)被顯著激活，而豬肝目前缺乏足夠的凝血調(diào)節(jié)能力，最終引發(fā)受體凝血紊亂。其主要病理特征為：TMA和（或）播散性血管內(nèi)凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）形成。這兩者均可發(fā)展為血小板減少癥、微血管性溶血性貧血和微血管血栓，最終導(dǎo)致器官缺血、梗塞和功能障礙。研究認(rèn)為，這與豬內(nèi)皮細(xì)胞的激活損傷相關(guān)，搞體和補(bǔ)體介導(dǎo)的內(nèi)皮激活使內(nèi)皮細(xì)胞由搞凝狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榇倌隣顟B(tài)。豬源性組織因子（tissue factor，TF）和受體TF的釋放會(huì)迅速啟動(dòng)外源性凝血系統(tǒng)。同時(shí)，損傷的內(nèi)皮和暴露的內(nèi)皮下組織會(huì)協(xié)同補(bǔ)體系統(tǒng)，共同激活血小板，導(dǎo)致其聚集、黏附和消耗。

多項(xiàng)研究表明，異種肝移植術(shù)后的凝血紊亂是一個(gè)多因素、多途徑共同作用的結(jié)果，多種機(jī)制均參與其中。單一的處理，如清除天然搞體、中和受體補(bǔ)體等并不能完全阻止其發(fā)生［10］。

3 丟失血小板的去向：聚集、激活或吞噬？

眾所周知，血小板是血管化器官移植存活的重要因素，其通過(guò)分泌多種趨化因子和表達(dá)相關(guān)受體的配體，如：MIP-1α、 RANTES、 MCP-3和PF4等，影響著單核/巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的交互作用。當(dāng)巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和激活的血小板一起定位到血管，通過(guò)受體與配體結(jié)合，細(xì)胞間的交互作用即開(kāi)始發(fā)生。激活的血小板表達(dá)P-選擇素和CD40L（CD154）。巨噬細(xì)胞表達(dá)PSGL-1、CD40和MAC-1。除了CD40，巨噬細(xì)胞表面的MAC-1也可以和血小板、T細(xì)胞表面表達(dá)的 CD154 相結(jié)合［11］。

為了更好地研究異種肝移植中血小板聚集、激活或吞噬的相關(guān)問(wèn)題，許多研究小組建立了豬-非人靈長(zhǎng)類的體外研究模型。或采用人血或狒狒的血液建立循環(huán)灌注系統(tǒng)來(lái)體外灌注豬的肝臟［12］。或直接分離肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)［13］。

3.1 體內(nèi)肝移植研究：匹茲堡的研究小組采用流式檢測(cè)分析了GTKO.hCD46供肝移植給狒狒后，受體血細(xì)胞-白細(xì)胞的黏附聚集情況［6］。研究發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重血小板減少癥的進(jìn)展和血小板自身以及血細(xì)胞-白細(xì)胞（尤其是單核細(xì)胞）的黏附聚集有關(guān)。盡管在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，平均血小板體積保持穩(wěn)定，但在移植后的第1小時(shí)內(nèi)血小板計(jì)數(shù)即出現(xiàn)明顯下降。移植后2小時(shí)的組織活檢證實(shí)，移植肝中有血小板和纖維蛋白的沉積。研究認(rèn)為，移植后早期受體血循環(huán)中血小板的丟失，部分是由于血小板自身以及血細(xì)胞-白細(xì)胞之間的黏附聚集造成的，這也是外周血的血小板計(jì)數(shù)偏低的原因。血小板在血液、移植肝以及可能在受體肺組織中的聚集均使其無(wú)法發(fā)揮正常生理功能，引起自發(fā)性出血［14］。通過(guò)共聚焦顯微鏡和電鏡可觀察到肝血竇中血小板的聚集，并伴有外周血單核細(xì)胞和纖維蛋白［15］。

他們也同時(shí)觀察到肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞的激活和循環(huán)血小板及外周血單個(gè)核細(xì)胞的變化。其中，內(nèi)皮細(xì)胞的激活分兩種類型，Ⅰ型激活由配體結(jié)合到G蛋白偶聯(lián)受體的胞外段介導(dǎo)，引起P-選擇素的表達(dá)和血管中血漿蛋白的滲出，這個(gè)過(guò)程需要10 ～ 20分鐘［16］。Ⅱ型激活由腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）刺激后誘發(fā)，通過(guò)合成黏附蛋白如：E-選擇素和CD106，增加白細(xì)胞的募集，這個(gè)過(guò)程維持6 ～ 24小時(shí)［17］。Ⅰ型和Ⅱ型激活被認(rèn)為分別與HAR和急性體液性異種移植排斥反應(yīng)（acute humoral xenografi rejection，AHXR）有關(guān)［18］。激活的內(nèi)皮細(xì)胞和生成的凝血酶進(jìn)一步激活血小板、白細(xì)胞和其他的炎性細(xì)胞，形成惡性循環(huán)。

研究發(fā)現(xiàn)，肝移植后2小時(shí)，循環(huán)血小板及外周血單個(gè)核細(xì)胞就已經(jīng)被激活，并開(kāi)始分泌組織因子CD142。血小板和內(nèi)皮細(xì)胞微粒檢測(cè)提示血漿中的微粒來(lái)源于血小板，呈TF（CD142）陽(yáng)性。搞豬CD31分子染色提示實(shí)驗(yàn)過(guò)程中只有少量的豬內(nèi)皮細(xì)胞被激活。同時(shí)，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)Ⅰ型（P-selectin）和Ⅱ型（E-selectin、CD106）內(nèi)皮激活，以及TF、von Willebrand因子（vWF）表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Ⅰ型和Ⅱ型內(nèi)皮激活的分子標(biāo)志以及CD142分子的表達(dá)在術(shù)后2小時(shí)即顯著降低，但在死亡觀察終點(diǎn)時(shí)（4 ～ 7天）仍可見(jiàn)其有表達(dá)。組織活檢顯示vWF移植前為陰性，移植后2小時(shí)呈陽(yáng)性，這提示豬源vWF激活了狒狒的血小板［15］，此結(jié)果和Schulte等［19］的報(bào)道一致。

Tector等［7］也觀察到血小板的激活和在受體肺組織中的聚集。不論是否有出血現(xiàn)象，受體自身肺組織的血小板染色均呈陽(yáng)性。但是，受體其他器官（心、腎、小腸和淋巴結(jié)）只有在出現(xiàn)大量間質(zhì)出血時(shí)，血小板染色才呈陽(yáng)性［3］。

3.2 離體血液灌注研究：印第安納波利斯的研究小組使用人血對(duì)野生型豬的肝臟進(jìn)行離體灌注，并在灌注過(guò)程的不同時(shí)間點(diǎn)（灌注前和灌注15、30、45、90和120分鐘）分別取肝組織活檢。他們發(fā)現(xiàn)肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞在灌注后15分鐘即開(kāi)始吞噬人的血小板［12］。馬里蘭的實(shí)驗(yàn)組曾嘗試是否能延緩血小板減少癥的進(jìn)展，他們利用全身肝素化的狒狒和GTKO.hCD46的豬肝臟建立了體外循環(huán)灌注系統(tǒng)。針對(duì)glycoprotein receptor（GP）IbvWF信號(hào)通路，灌注前對(duì)供豬給予去氨加壓素清除vWF，并在開(kāi)始灌注時(shí)和灌注后30分鐘對(duì)受體給予anti-GPIb搞體，他們成功將血小板減少癥延緩至灌注后3小時(shí)［20］。

作為肝移植的替代選擇，有研究組建議用豬肝作離體灌注來(lái)“橋接”同種肝移植。Rees等［21］用人血灌注豬肝15分鐘即發(fā)現(xiàn)血小板計(jì)數(shù)降至30 000/mm3以下，并伴有紅細(xì)胞的丟失。在使用野生型豬和hCD55轉(zhuǎn)基因豬的肝臟進(jìn)行相同的體外灌注72小時(shí)后，可觀察到等量的（3 units）人血紅細(xì)胞被消耗，這種針對(duì)人紅細(xì)胞的移植物搞宿主反應(yīng)并不是由經(jīng)典的補(bǔ)體激活溶解途徑引起，而是由肝臟中的Kupffer細(xì)胞吞噬造成的，并且這種吞噬和調(diào)理作用無(wú)關(guān)［22-23］。

Burlak等［24］認(rèn)為豬 Kupffer細(xì)胞識(shí)別人紅細(xì)胞是依賴人紅細(xì)胞表面的N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-Acetylneuraminic Acid，NANA，Neu5Ac，唾 液酸的一種類型）的表達(dá)。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，使用Neu5Ac預(yù)處理Kupffer細(xì)胞后，其對(duì)紅細(xì)胞的結(jié)合明顯減少。這項(xiàng)研究說(shuō)明去除人紅細(xì)胞表面的唾液酸表達(dá)可完全廢除Kupffer細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬效應(yīng)。

了解到人紅細(xì)胞表面的低聚糖是導(dǎo)致豬巨噬細(xì)胞與人紅細(xì)胞相互作用的原因后，Brock等［25］鑒定了豬巨噬細(xì)胞表面可能參與此作用的植物凝集素。唾液酸黏附素（sialoadhesin，CD169）被認(rèn)為介導(dǎo)了豬巨噬細(xì)胞和人紅細(xì)胞表面Neu5Ac的結(jié)合。此外，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)使用搞豬CD169單克隆搞體預(yù)處理豬的Kupffer細(xì)胞可降低其與人紅細(xì)胞的結(jié)合率，達(dá)到和同種移植相同的水平。Waldman等［26］也利用分離的人紅細(xì)胞灌注野生型豬的肝臟72小時(shí)，同時(shí)使用搞豬CD169單克隆搞體，發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞的破壞明顯減少，肝功能也得到改善。

3.3 體外細(xì)胞干預(yù)研究：肝臟是補(bǔ)體蛋白的合成位點(diǎn)，除外C1q、D因子及備解素和C7。異種肝移植后，移植物將合成豬源補(bǔ)體蛋白。豬補(bǔ)體不會(huì)對(duì)移植肝造成損傷，特別是在GTKO豬表達(dá)hCD46分子或其他人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白的情況下。匹茲堡的研究小組證實(shí)［27］，相對(duì)于人補(bǔ)體，豬補(bǔ)體對(duì)移植肝的損傷小得多。異種肝移植后，總體的補(bǔ)體活性基本保持穩(wěn)定或有所升高。他們還證實(shí)，GTKO.hCD46豬來(lái)源的外周血單個(gè)核細(xì)胞會(huì)發(fā)生較少的補(bǔ)體或搞體介導(dǎo)的溶細(xì)胞效應(yīng)。

在體外灌注實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了血小板是被豬肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞和肝細(xì)胞吞噬之后，印第安納波利斯的研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探索了引起血小板減少的受體-配體相互作用。他們將注意力放在了脫唾液酸糖蛋白受體-1（asialoglycoprotein receptor-1，ASGR1）的作用上，該蛋白參與了血小板的清除過(guò)程。分別分離野生型和GTKO.hCD55豬的肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞和帶有熒光標(biāo)記的人血小板進(jìn)行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)ASGR1與血小板吞噬產(chǎn)生共定位，使用去唾液酸糖蛋白和ASGR1特異性搞體可抑制血小板的結(jié)合和吞噬，并呈劑量依賴性。同時(shí)，使用siRNA降低肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞ASGR1的表達(dá)，血小板的吞噬效率會(huì)降低21%～31%左右［28］。

Kupffer細(xì)胞是肝臟巨噬細(xì)胞，同樣參與了血小板的吞噬過(guò)程。CD11b/CD18（MAC-1）是和吞噬相關(guān)的受體。印第安納波利斯課題組研究了CD11b/CD18在野生型和GTKO.hCD55豬源Kupffer細(xì)胞吞噬人血小板過(guò)程中的作用［29］。當(dāng)吞噬發(fā)生時(shí)，CD18和血小板產(chǎn)生共定位，搞CD18單克隆搞體可抑制這種吞噬作用，在野生型和GTKO.hCD55型Kupffer細(xì)胞中的抑制效率分別為43%～73%和18%～55%。波士頓的研究小組通過(guò)分離野生型和GTKO豬的肝細(xì)胞和肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞，探索了整合素依賴的狒狒血小板的激活和吞噬，他們發(fā)現(xiàn)豬源肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)豬的血小板不發(fā)生吞噬作用，但是會(huì)對(duì)狒狒的血小板發(fā)生強(qiáng)烈的吞噬效應(yīng)。雖然豬源肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞和主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞均吞噬狒狒血小板（肝血竇內(nèi)皮的吞噬作用更強(qiáng)），但體外未發(fā)現(xiàn)豬肝細(xì)胞對(duì)血小板的吞噬作用［30］。有研究發(fā)現(xiàn)，人類血小板Galβ和βGlcNAc半乳糖的暴露程度是新鮮豬血小板的4倍，Galβ和βGlcNAc在豬血小板上不被唾液酸所掩蓋，從人類血小板中去除唾液酸會(huì)增加肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞的結(jié)合和吞噬作用［13］。

4 凝血障礙相關(guān)干預(yù)方案

4.1 信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α（signal regulatory protein-α，SIRPα）-CD47：肝臟巨噬細(xì)胞（Kupffer細(xì)胞）和肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)SIRPα，它能使細(xì)胞分清自我和非我從而調(diào)控吞噬作用。CD47是SIRPα識(shí)別自我的蛋白分子，在紅細(xì)胞和血小板上均有表達(dá)，正常情況下，SIRPα-CD47的相互作用可以防止吞噬。研究表明人SIRPα可和豬CD47分子結(jié)合，甚至表現(xiàn)出更高的親和力，但卻無(wú)法發(fā)揮出抑制吞噬的作用。豬SIRPα和人CD47分子之間也存在種屬不兼容問(wèn)題，兩者相互作用不能抑制豬源細(xì)胞對(duì)人血小板的吞噬。盡管理想的基因改造方法是使豬的肝臟表達(dá)人SIRPα，但是人SIRPα和豬CD47分子的親和力遠(yuǎn)高于人CD47，無(wú)法產(chǎn)生抑制酪氨酸磷酸化的信號(hào)。同時(shí)，人SIRPα和內(nèi)源豬SIRPα之間還會(huì)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，使情況變得更為復(fù)雜［31］。

SIRPα不僅表達(dá)在肝臟內(nèi)皮細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞，循環(huán)巨噬細(xì)胞同樣有表達(dá)，因此，循環(huán)巨噬細(xì)胞同樣需要內(nèi)皮或其他細(xì)胞提供CD47信號(hào)來(lái)防止被激活。Zhang等［32］和Tena等［33］分別報(bào)道繁育出導(dǎo)入人CD47的小型豬，但是進(jìn)行異種肝移植后的結(jié)果卻不盡如人意。這可能與CD47介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和增強(qiáng)血管收縮功能有關(guān)，因此，CD47的過(guò)表達(dá)對(duì)移植物本身可能是有害的。此外，CD47還是血小板反應(yīng)素-1（thrombospondin-1，TSP-1）的受體，而TSP-1在血小板聚集和血栓形成中發(fā)揮重要作用［34］。

4.2 血栓調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin，TM）：豬的血栓調(diào)節(jié)蛋白很難激活人凝血酶，導(dǎo)致活化型的人蛋白C（active protein C，aPC）生成減少。目前世界上已有許多研究成功培育出表達(dá)人源TM（hTM）的小型豬。已有的體外證據(jù)和轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)表明，hTM的表達(dá)對(duì)調(diào)節(jié)異種移植過(guò)程中的凝血功能障礙和炎癥有益［35］。目前，匹茲堡的研究團(tuán)隊(duì)利用GTKO/hCD46/hTM和GTKO/hCD55/hCD59/hCD39/hTM兩種類型的轉(zhuǎn)基因豬，在異種心臟移植中證實(shí)，導(dǎo)入hTM可以維持血小板和纖維蛋白原的穩(wěn)定，血小板的激活明顯減弱，消耗性凝血障礙得到緩解。盡管這些體內(nèi)研究結(jié)果非常鼓舞人心，為跨物種不兼容相關(guān)凝血障礙提供了可能的解決途徑，但是，在此基礎(chǔ)上再導(dǎo)入內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體可能效果會(huì)更顯著。

4.3 組織因子途徑抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）：TF 又稱為血小板組織因子（platelet tissue factor）、因子Ⅲ和CD142，在內(nèi)皮下組織和白細(xì)胞均有表達(dá)，在凝血過(guò)程中的作用是啟動(dòng)外源性凝血途徑，促進(jìn)血栓生成。TFPI是一種單鏈多肽，它可以可逆地抑制因子X(jué)a（FXa）。當(dāng)FXa被抑制時(shí)，F(xiàn)Xa-TFPI復(fù)合體也可以抑制FⅦa-TF復(fù)合體，抑制外源性凝血過(guò)程。生理情況下，TF和TFPI兩者處于動(dòng)態(tài)平衡。早期的證據(jù)證實(shí)豬的TFPI和人的FXa不兼容，然而，后來(lái)有體外研究證實(shí)，合適糖基化修飾的重組豬源TFPI和人TF途徑?jīng)]有明顯的不兼容現(xiàn)象。最近，西安的竇科峰教授課題組在豬的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中導(dǎo)入人的TFPI，發(fā)現(xiàn)其能夠通過(guò)人TF途徑調(diào)節(jié)凝血異常［36］。另外，豬的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)人TFPI是有益的，因?yàn)門FPI會(huì)迅速地由炎性血管內(nèi)皮脫落。目前，世界上僅培育出胰腺特異性表達(dá)TFPI的小型豬，對(duì)于肝臟而言，將來(lái)TFPI的表達(dá)最好局限在血管內(nèi)皮細(xì)胞，因?yàn)門FPI的過(guò)表達(dá)可能對(duì)豬的存活不利。

4.4 三磷酸腺苷二磷酸水解酶-1（CD39）/胞外核苷酸酶（CD73）：膜外CD39分子參與了ATPADP-AMP的分解過(guò)程。CD73分子負(fù)責(zé)催化AMP水解成腺苷（一種搞血栓和心血管保護(hù)的介質(zhì)）。Dwyer等最早報(bào)道，在小鼠中轉(zhuǎn)入人的CD39（hCD39）分子可以使其血小板聚集功能受損，延長(zhǎng)出血時(shí)間，減少系統(tǒng)性血栓栓塞的發(fā)生［37］。Wheeler等［38］的研究表明，在豬中導(dǎo)入 hCD39 分子，發(fā)現(xiàn)能明顯保護(hù)心肌。有研究顯示，敲除CD73分子對(duì)體內(nèi)血栓形成影響很小，但是增加造血來(lái)源細(xì)胞表面CD39分子的表達(dá)（特別是單核細(xì)胞），會(huì)明顯延緩動(dòng)脈血栓形成［39］。在豬到非人靈長(zhǎng)類的異種腎移植大動(dòng)物研究中，GTKO/ hCD55/hCD59/hCD39的轉(zhuǎn)基因豬并沒(méi)有帶來(lái)令人鼓舞的結(jié)果［40］。

4.5 von Willebrand因子（vWF）：豬vWF可以激活受體狒狒的血小板，有證據(jù)表明，敲除豬vWF后需要同時(shí)導(dǎo)入人vWF，因?yàn)関WF敲除豬有出血傾向。但是，由于vWF基因復(fù)雜且定位較寬，使豬表達(dá)人vWF是十分困難的。Schulte Am Esch教授證實(shí)了豬vWF和人血小板GPIb受體的種間功能不兼容，因此，可以嘗試選擇性的調(diào)控豬vWF在個(gè)體化GPIb的結(jié)合位點(diǎn)。血小板vWF受體的唾液酸表達(dá)水平不同會(huì)導(dǎo)致脫唾液酸的水平也不同，這會(huì)增加血小板的清除，此過(guò)程在異種肝移植中會(huì)尤為明顯。

4.6 人凝血酶原復(fù)合物（human prothrombin concentrate complex，hPCC）：針對(duì)豬到非人靈長(zhǎng)類異種肝移植中血小板減少導(dǎo)致的致死性出血問(wèn)題，美國(guó)麻省總院的肝移植團(tuán)隊(duì)，在2例GTKO-狒狒的肝移植過(guò)程中持續(xù)輸注了外源性的hPCC，并測(cè)定了血循環(huán)中維生素K依賴凝血因子和非維生素K依賴凝血因子的活動(dòng)度，提示移植肝臟有新生凝血因子生成，受體出血異常得到明顯改善。最后，2例受體的存活時(shí)間分別延長(zhǎng)至 25［41］和 29 天［1］。

5 小 結(jié)

總之，關(guān)于改善豬-猴異種肝移植過(guò)程中凝血功能調(diào)節(jié)障礙的各種策略作用均是有限的，因此，多種途徑聯(lián)合可能有更顯著的效果。在目前基本克服了HAR和急性血管性排斥反應(yīng)之后，我們有理由相信，如果嚴(yán)重的血小板丟失也能夠被克服，凝血調(diào)節(jié)障礙能進(jìn)一步被有效控制，那么異種肝移植的臨床應(yīng)用（特別是對(duì)急性暴發(fā)性肝臟功能衰竭患者進(jìn)行“橋接”治療）將會(huì)變得越來(lái)越近。