秦園，陳祝軍

（張家港市疾病預防控制中心，江蘇 張家港 215600）

質譜分析是將待測物質電離化，并通過質荷比來檢測和鑒定不同物質的一種技術。在很長一段時間里，質譜分析的運用只停留在化學研究領域，并通常和一些預分離技術串聯(lián)使用，如液相質譜和氣相質譜等，但液相質譜和氣相質譜無法對生物分子進行空間定位分析。

1988年Karas和Hillenkamp第一次報道了基質輔助激光解吸電離質譜技術(Matrix assisted laser desorption ionization-mass spectrometry, MALDI-MS)的相關實驗，他們通過MALDI-MS技術成功地將血清白蛋白從煙堿酸基質中電離出來，這次突破性的研究為分析科學領域開辟了新的前景。隨著電子噴霧離子化(Electron spray ionization, ESI)和基質輔助激光解吸離子化(Matrix assisted laser desorption ionization, MALDI)技術的發(fā)展，以ESI和MALDI為基礎的MALDI-MS技術解決了質譜對生物分子進行空間定位分析的問題，該技術能有效地通過生物分子的離子化，檢測其在組織樣品中的準確位置。MALDI-MS在化學、生物和醫(yī)學等領域發(fā)揮著重大的作用，對于研究動植物體內、外特異性分子的分布有巨大的前景。質譜的優(yōu)勢在于其精確性，而MALDI加快了檢測的速度，MALDI-MS則是集兩者于一身的具有高速率、高精確度的檢測技術，且MALDI-MS能在飛摩（10～15）乃至阿摩（10～18）水平檢測相對分子量高達幾十萬的生物大分子。

1 MALDI-MS的技術原理

MALDI-MS技術原理是在MALDI離子源部分，用激光照射在樣品與基質形成的共結晶薄膜上，基質從激光中吸收能量并傳遞給樣品，使樣品中的分子形成質子化、堿金屬加成的（M+H）+、（M+Na）+、（M+K）+或脫氫得到（M-H）+等系列準分子離子，形成的離子在質譜系統(tǒng)中得以分離和檢測的過程。

MALDI-MS基本工作流程大體包括4部分：樣品切片的制備、基質體系的確立與覆蓋、質譜分析、數(shù)據(jù)統(tǒng)計及處理，其中基質體系及其覆蓋方式是MALDIMS的關鍵部分，決定能否獲得高質量的成像?；|系統(tǒng)是能與樣品混合或包被的具有能量吸附作用的有機化合物溶液，常用的基質有：α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, CHCA），二羥基苯甲酸（2,5-dihydroxybenzoic acid, DHB）和3,5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸（3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid, SA）。SA和CHCA通常用于檢測高、中分子量的蛋白質和肽段；DHB主要用于低分子量的檢測，包括：脂類、核酸和陽離子代謝物；9-氨基吖啶（9-aminoacridine, 9-AA）適用于低分子量代謝物的分析，例如一些陰離子代謝物。

2 MALDI-MS的應用

2.1 MALDI-MS在食品中的應用

當前食品安全越來越受到人們的重視，提高食品檢測、分析方法的準確性和精確性十分重要。對于食品檢測，目前普遍、常用的檢測技術多為高效液相質譜聯(lián)用儀或氣相質譜聯(lián)用儀，主要分析食品中的化學成份，有助于觀測食物的功能性和安全性。但隨著食品檢測項目的擴展和深入，傳統(tǒng)檢測技術對于研究動植物食品中特異性分子的空間分部具有局限性。

MALDI-MS作為一種新型的檢測技術，該技術有其他技術無可比擬的優(yōu)點：（1）樣品無需復雜的前期處理，如提取、純化、分離和標記。（2）可清晰地觀察食品中化學、生物成份的空間分布。MALDI-MS技術已經作為一種新手段應用于食品檢測。

MALDI-MS屬于一種軟電離技術，更適用于混合物及生物大分子的測定，是檢測食品中的蛋白質、脂質等的重要手段。實驗證明，MALDI-MS能有效的檢測新鮮牛奶中添加的奶粉成份和新鮮羊奶中牛奶的成份，可有效區(qū)分混合蛋白食品中不同的蛋白成份。MALDI-MS可以同時檢測食品中不同脂類的分布，Horn等研究發(fā)現(xiàn)：在MALDI-MS的幫助下，檢測到了甘油三酯和磷脂在棉籽中的分布；還清晰直觀的觀察到甘油三酯在牛油果果皮中的分布。Sroyraya通過 MALDI-MS觀察到卵磷脂、甘油三酯和鞘磷脂在遠洋梭子蟹眼柄中的分布。Zaima等通過MALDI-MS觀察到稻谷中溶血磷脂酰膽堿的具體分布，同時還從數(shù)據(jù)的角度解釋了釀酒過程中磨米步驟的重要性，而這一重要且不可缺少的釀酒步驟，在之前一直未被解釋清楚。

雖然MALDI-MS作為新型技術彌補了傳統(tǒng)技術存在的局限性，但其也并不是十全十美，在某些檢測領域仍有短板。Parisa A等發(fā)現(xiàn)MALDI-MS在檢測白霉乳酪中的桔青霉素時，基質會對結果產生干擾，用13C作為內標，可減少基質產生的干擾。

2.2 MALDI-MS在微生物中的應用

自然界中，每種微生物均有其區(qū)別于其他種類的獨特的蛋白質組成，且這種遺傳特性受外界環(huán)境條件等影響較小?；诩毦禺愋缘鞍追肿拥腗ALDI-MS技術是一種全新的微生物快速檢測和鑒定技術。應用質譜技術將測得的蛋白質和多肽按分子量大小排列，形成獨特的蛋白質組指紋圖，通過特征性的模式峰可進行菌株的鑒定。

近年來，西方國家的MALDI-MS技術在微生物實驗室廣泛應用，與此同時，國內學者們也逐漸重視MALDI-MS在食品微生物鑒定分型方面的應用。MALDI-MS在鑒定食品微生物（如，細菌、酵母菌和大腸桿菌）方面，操作步驟包括：樣品準備、點樣、質譜分析，通過質譜圖與Biotyper數(shù)據(jù)庫標準圖譜進行比對分析，即可獲得鑒定報告。MALDI-MS最大的優(yōu)勢在于：在鑒定過程中，能進行圖像觀測、實時數(shù)據(jù)分析，而且數(shù)據(jù)能同時批量化處理和編輯，大大縮短了鑒定菌種的時間。

MALDI-MS還廣泛用于食源性致病菌的快速鑒定。該方法比傳統(tǒng)的鑒定方法速度快，并克服了分子生物學方法不能鑒定到種水平、易污染和易出現(xiàn)假陽性結果的缺陷。同時MALDI-MS技術也已經運用于食品微生物分型和溯源分析上，王耀等人建立單增李斯特氏菌的MALDI-MS快速鑒定和分型方法，并對建庫菌株進行同源性分析，為追蹤食源性的病菌污染源提供技術支持。

MALDI-MS能快速鑒定單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）； 在 沙 門 氏 菌（Salmonella sp．） 的血清分型中表現(xiàn)出較好的能力；對于脆弱擬桿菌（b．fragilis）鑒定與生化測試方法相比，MALDI-MS鑒定的能力更高、準確性更好；在阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）等病原菌的快速鑒定應用方面取得很好的效果；以及對于實驗室培養(yǎng)、鑒別和分類都比較困難的梭菌，MALDI-MS技術可以快速、準確的鑒定。非發(fā)酵菌是人體的機會致病菌，如今已成為院內感染的重要致病菌，而傳統(tǒng)表型鑒定方法常出現(xiàn)誤診，MALDI-MS技術在鑒定非發(fā)酵菌方面已表現(xiàn)出一定的優(yōu)越性。在植物細菌鑒定領域，MALDI-MS可以有效鑒定多種生態(tài)地區(qū)來源的枯萎癥病原，還可以用于細菌屬的鑒定。

2.3 MALDI-MS在其他領域的應用

MALDI-MS在臨床上也展現(xiàn)其實用性，MALDIMS可同時分析組織中成千上萬的蛋白質分布的空間位置，但不需要對蛋白質進行標記。

激光共聚焦掃描顯微技術通過染色技術，可在亞細胞水平觀察蛋白質等分子的變化，但對未知蛋白質等鑒定很難。但是以MALDI-MS為基礎的基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry, MALDITOF-MS)，通過直接掃描生物樣品，能研究蛋白質等分子在細胞或組織中的分布，或鑒定細胞中的特征分子，從而可將疾病的發(fā)生部位、進程與相關分子緊密聯(lián)系起來；另一方面，MALDI-MS可準確顯示藥物及其代謝產物在組織中的分布，揭示它們在體內的位置和生物轉化途徑。Khatib-Shahidi等已把基于MALDI-MS的質譜成像方法應用于生物藥劑學中，將單一的器官組織分析進一步發(fā)展到了整體組織中。

另外，研究證明MALDI-MS在臨床上可輔助尋找機體潛在的生物標志物，為疾病臨床的早期診斷提供參考依據(jù)；并能夠在組織中研究潛在生物標志物的空間分布及表達的上調或下調，在癌癥診斷、病程監(jiān)控、外科切除有效性評價中具有重要價值。Skold等利用MALDI-MS分子成像技術，在小鼠模型中尋找帕金森病的生物標志物。MALDI-MS用于組織成像是一種全新的分子成像技術，它不局限于特異的一種或者幾種分子，它可在組織切片中同時找到多種分子，并提供這些分子在組織中空間分布的精確信息，同時可對這些蛋白質分子的含量進行相對定量。Stoeckli等第一次證明MALDI-MS在病理學研究中適用，獲得惡性膠質瘤中不同蛋白的不同分布的影像。與其他檢測方式相比，MALDI-MS還較多用于單核苷酸多態(tài)性的分型研究上。

MALDI-MS在機體過敏原檢測方面，在建立肽段識別和臨床過敏原之間的相關性領域都有重要意義。從而可提升臨床上過敏原的診斷方法、判斷標準和有效的治療手段，是MALDI-MS在醫(yī)學領域有待發(fā)展的方向。

3 發(fā)展前景

雖然MALDI-MS在醫(yī)學、生物、分析化學等領域有了不小的發(fā)展，但仍存在許多問題和挑戰(zhàn)尚待解決。例如：基質種類選擇性?。换|有可能帶來檢測的干擾，影響結果的準確性；優(yōu)秀的質譜圖像自動化分析軟件以及不同組織樣本之間差異分子比較分析所必需的統(tǒng)計軟件還亟待開發(fā)；在如何處理大量質譜數(shù)據(jù)并給出可用于臨床的診斷分析結果上，還未形成共識；在獲取生物組織中小分子化合物的信息時，還必須使用多級串聯(lián)的質譜分析器等。

隨著質譜技術、蛋白質科學和生物信息學等生命科學關鍵領域的發(fā)展，MALDI-MS技術將有可能在功能基因組學、臨床蛋白質組學、代謝組學和生物標志物發(fā)現(xiàn)等方面發(fā)揮巨大作用，并將在食品、環(huán)境檢測、臨床醫(yī)學、新藥開發(fā)等眾多科學領域中作為新的實驗手來段廣泛運用。

[1]KARAS M, HILLENKAMP F． Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons [J]． Anal Chem, 1988, 60 (20): 2299-2301．

[2]YOSHINORI F, DAISUKE M． MALDI mass spectrometry imaging for visualizing in situ metabolism of endogenous metabolites and dietary phytochemicals [J]． Metabolites, 2014, 4:319-346．

[3]張瑩，陸豪杰等． 基質輔助激光解吸電離質譜用于生物組織的質譜成像應用進展 [J]． 質譜學報，2009, 30(4): 250-256．

[4]YUKIHIRO Y, NAOKO G I, et al． Significant advancement of mass spectrometry imaging for food chemistry [J]． Food Chem,2016,(210): 200-211．

[5]SHROFF R, MUCK A, et al． Analysis of low molecular weight acids by negative mode matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry [J]． Rapid Commu． Mass Spectrom, 2007, (21）: 3295-3300．

[6]Careri M, Bianchi F, et al． Recent advances in the application of mass spectrometry in food-related analysis [J]． J Chromatogr A,2002, (970): 3-64．

[7]HORN P J, KORTE A R, et al． Spatial mapping of lipids at cellular resolution in embryos of cotton [J]． Plant Cell, 2012, 24(2):622-636．

[8]HORN P J, JAMES C N, et al． Identification of a new class of lipid droplet-associated proteins in plants [J]． Plant Phys, 2013, 162(4):1926-1936．

[9]SROYRAYA M, GOTO-INOUE N, et al． Visualization of biomolecules in the eyestalk of the blue swimming crab, portunus pelagicus, by imaging mass spectrometry using the atmosphericpressure mass microscope [J]． Surf． Inter． Anal, 2010, 42(10-11):1589-1592．

[10]ZAIMA N, YOSHIMURA Y, et al． Distribution of lysophosphatidylcholine in the endosperm of Oryza sativa rice [J]．Rapid Commu． Mass spectrom, 2014, 28(13): 1515-1520．

[11]PARISA A, GEORG H． Determination of cyclopiazonic acid in white mould cheese by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) using a novel internal standard [J]．Food Chem, 2016, (211): 978-982．

[12]LV J, LU X A, LIU S Y, et al． Factors affecting the identification of bacteria using mass spectrometry [J]． Anal Chem, 1975, 47(2):219-225．

[13]饒名禎，顧晨榮，李云霞等． MALDI-TOF MS技術在食品微生物領域的應用研究 [J]． 上海師范大學學報, 2015, 44(6)：681-686．

[14]WANG Y, CAO J J, ZHAO X, et al． Identification and subtyping of Listeria monocytogenes by matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry [J]． Food Sci, 2012,33(3): 194-198．

[15]楊捷琳，魏黎明，顧鳴等． 食源性李斯特菌蛋白質雙向電泳圖譜及穩(wěn)定生長期細菌蛋白質分析 [J]． 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2009，19(3): 491．

[16]呂佳，盧行安，劉淑艷等． MALDI-TOF-MS鑒定2008年遼寧省食源性疾病監(jiān)測系統(tǒng)檢出的沙門菌的初步研究 [J]． 中國食品衛(wèi)生雜志, 2011,61-19．

[17]趙貴明，楊海榮，趙勇勝等． MALDI Biotyper與API20E對克羅諾桿菌（阪崎腸桿菌）的鑒定結果比較 [J]． 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010, 20(3): 464-466．

[18]MELLMANN A, BIMET F, et al． High interlaboratory reproducibility of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry-based species identification of nonfermenting bacteria [J]． J Clin Microb, 2009, 47(11): 3732-3734．

[19]陳信忠，龔艷清，郭書林． MALDI-TOF-MS在病原微生物鑒定中的研究進展 [J]． 生物技術通報, 2012, (6): 43-48．

[20]NEELJA S, MANISH K, et al． MALDI-TOF mass spectrometry:an emerging technology for microbial identification and diagnosis[J]． Front Microbiol, 2015, 6(791):1-16．

[21]劉念，魏開華，張學敏等． 臨床質譜學的最新進展：質譜成像方法及其應用 [J]． 中國儀器儀表, 2007, (10): 76-80．

[22]SKOLD K, SVENSSON M, NILSSON A, et al． Decreased striatal levels of PEP-19 following MPTP lesion in the mouse [J]． J Proteome Res, 2006, 5(2): 262-269．

[23]LIAM A, RON M A． Imaging mass spectrometry [J]． Mass Spectrom Rev, 2007, (26): 606-643．

[24]GIANLUCA P, GIANFRANCO M, et al． The frontiers of mass spectrometry-based techniques in food allergenomics [J]． J Chrom A, 2011, (1218): 7386-7398．