尤奇，段小軍，楊柳，劉毅

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，貴州 遵義 563003；2.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，重慶 400038)

關(guān)節(jié)軟骨缺損在臨床中的發(fā)病率極高，是導(dǎo)致肢體殘障的主要原因，并給社會(huì)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。關(guān)節(jié)軟骨血液供應(yīng)的貧乏使得其修復(fù)顯得尤為困難，并長(zhǎng)期困擾著廣大臨床醫(yī)生。該缺損常表現(xiàn)為頑固性疼痛和進(jìn)行性關(guān)節(jié)功能減退，最終可引起退行性骨關(guān)節(jié)炎[2]。Curl等[3]對(duì)美國(guó)31 516例膝關(guān)節(jié)損傷患者行關(guān)節(jié)鏡探查，發(fā)現(xiàn)有63%的患者存在不同程度的軟骨損傷。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)每年有30 000～100 000例軟骨缺損患者需要手術(shù)治療[4]。在2000年，美國(guó)骨關(guān)節(jié)炎治療費(fèi)用達(dá)600億美元，預(yù)計(jì)到2020年骨關(guān)節(jié)炎花費(fèi)將增加到1 000億美元[5]。近年來(lái)，隨著再生醫(yī)學(xué)和材料學(xué)的迅速發(fā)展，軟骨細(xì)胞、軟骨組織以及支架材料運(yùn)用于軟骨缺損的修復(fù)均取得了顯著的效果，而且其修復(fù)組織的結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)性能近似透明軟骨?，F(xiàn)就軟骨組織工程技術(shù)在臨床上的推廣應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 傳統(tǒng)治療方法

臨床上治療軟骨缺損的傳統(tǒng)方法很多，但每種方法均有其局限性，并不能很好的滿(mǎn)足臨床要求。a)保守治療雖能夠暫時(shí)緩解臨床癥狀，但對(duì)于軟骨缺損直徑大于4 mm的患者幾乎無(wú)修復(fù)作用，更不能恢復(fù)其生物學(xué)組織結(jié)構(gòu)和功能。b)關(guān)節(jié)清理術(shù)只是對(duì)關(guān)節(jié)局部病灶的清理，僅能改善癥狀并不能修復(fù)軟骨缺損。c)骨髓刺激術(shù)常用于較小的缺損，形成的多為纖維軟骨，其結(jié)構(gòu)組成和生物力學(xué)性能相較于透明軟骨差[6]。d)骨軟骨移植術(shù)分為自體骨軟骨移植和同種異體骨軟骨移植，自體骨軟骨移植手術(shù)操作簡(jiǎn)單而且是一期手術(shù)，但面臨著軟骨來(lái)源有限和供區(qū)并發(fā)癥等不足[7]；同種異體骨軟骨移植可以修復(fù)較大的軟骨缺損，但存在著免疫排斥和疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)。e)人工關(guān)節(jié)置換術(shù)面臨術(shù)后骨溶解、遠(yuǎn)期關(guān)節(jié)功能退變以及費(fèi)用高等問(wèn)題。以上治療方法雖能暫時(shí)改善關(guān)節(jié)活動(dòng)功能，但長(zhǎng)期效果還不能滿(mǎn)足臨床要求。

2 軟骨組織工程

隨著材料學(xué)、再生醫(yī)學(xué)以及相關(guān)生物化學(xué)的迅速發(fā)展，Langer等[8]提出了組織工程的概念，組織工程學(xué)綜合了材料學(xué)、再生醫(yī)學(xué)以及相關(guān)生命科學(xué)的基本原理和方法，將分離、提取的細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增，然后復(fù)合于組織相容性良好、可降解吸收的的三維支架材料上，形成具有生物活性的復(fù)合物，然后植入體內(nèi)修復(fù)病損部位。近年來(lái)，軟骨組織工程技術(shù)經(jīng)過(guò)前期大量有效的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于臨床，未來(lái)有著廣闊的發(fā)展前景。

3 新技術(shù)的臨床應(yīng)用

3.1 軟骨細(xì)胞移植 軟骨細(xì)胞移植(autologous chondrocyte implantation，ACI)是將分離、獲取的自體軟骨細(xì)胞先進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增的細(xì)胞按一定的密度移植于軟骨缺損的部位，進(jìn)行軟骨缺損的修復(fù)。研究表明，體外擴(kuò)增培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞能夠較好的維持其細(xì)胞特性，利于軟骨缺損的修復(fù)[9]。ACI對(duì)于治療中等軟骨缺損、骨軟骨炎引起的軟骨缺損具有良好的修復(fù)效果，但尚不適用于有關(guān)節(jié)炎癥、傳染性疾病以及局部感染等患者。

1989年，Grande等[10]報(bào)道了兔自體軟骨細(xì)胞移植治療膝關(guān)節(jié)軟骨缺損，術(shù)后16周軟骨缺損得到修復(fù)，并且修復(fù)區(qū)域表現(xiàn)為透明樣軟骨組織，此為第1代ACI技術(shù)，即骨膜-自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)(periosteal autologous chondrocyte implantation，P-ACI)。1994年Brittberg等[11]應(yīng)用該技術(shù)成功治療了人關(guān)節(jié)軟骨缺損，這為該技術(shù)在臨床中的推廣應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。1995年美國(guó)Genzyme公司利用該技術(shù)生產(chǎn)出了Carticel?產(chǎn)品，1997年后該產(chǎn)品逐漸在臨床得到推廣應(yīng)用。2000年P(guān)eterson等[12]報(bào)告了101例膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的患者接受ACI治療后的隨訪(fǎng)情況，其中對(duì)94例患者進(jìn)行了2～9年的隨訪(fǎng)，結(jié)果證明其臨床有效率達(dá)87.5%以上，但術(shù)后存在骨膜脫落、細(xì)胞逸散、骨質(zhì)增生、骨膜肥大等并發(fā)癥。后來(lái)Haddo等[13]用一種Ⅰ/Ⅲ型膠原雙層支架薄膜代替骨膜進(jìn)行對(duì)照研究，通過(guò)1年的術(shù)后隨訪(fǎng)，該方法取得了良好的臨床效果：不僅無(wú)骨膜肥大、剝脫等并發(fā)癥，同時(shí)此方法避免了因獲取骨膜而增加的額外創(chuàng)傷，該技術(shù)被視為第2代ACI技術(shù)，即膠原膜-自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)(collagenic autologous chondrocyte implantation，C-ACI)。Niemeyer等[14]對(duì)第2代ACI技術(shù)(C-ACI)治療的23例膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的患者和第1代ACI技術(shù)(P-ACI)治療的23例膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的患者進(jìn)行了隨訪(fǎng)，術(shù)后10年通過(guò)Lysholm和IKDC評(píng)分進(jìn)行比較，證明了C-ACI的臨床長(zhǎng)期療效要優(yōu)于P-ACI。Filardo等[15]報(bào)道了用C-ACI治療的58例患者，在術(shù)后第2年和第6年進(jìn)行了隨訪(fǎng)，結(jié)果顯示膝關(guān)節(jié)功能得到明顯改善，但存在細(xì)胞分布不均勻和膠原膜脫落。隨著組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展，部分學(xué)者將軟骨細(xì)胞種植于仿生支架材料內(nèi)形成復(fù)合體，然后利用有活性的復(fù)合體去修復(fù)軟骨缺損，該技術(shù)被稱(chēng)為第3代ACI技術(shù)，即基質(zhì)誘導(dǎo)的自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)(matrix-induced autologous chondrocyte implantation，MACI)。Kon等[16]應(yīng)用MACI技術(shù)對(duì)141位患者治療后隨訪(fǎng)，76%的患者疼痛消失，88%的患者運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)正常。Gille等[17]用MACI技術(shù)對(duì)38位患者進(jìn)行了治療，術(shù)后15年進(jìn)行隨訪(fǎng)，結(jié)果證實(shí)86%的患者膝關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)功能得到明顯提升，100%的患者膝關(guān)節(jié)功能都要好于術(shù)前。典型代表產(chǎn)品為修復(fù)較小缺損的Hyalograft?C(NeoCartTM)和修復(fù)較大缺損的Novocart 3D?(NeoCartTM)。最新的MACI使用生物相容性較好的纖維蛋白凝膠進(jìn)行粘合，避免了術(shù)中手術(shù)縫合，簡(jiǎn)化了以前復(fù)雜的操作步驟，縮短了手術(shù)時(shí)間，降低了細(xì)胞外漏的風(fēng)險(xiǎn)，軟骨缺損修復(fù)效果更好。有研究者采用患者自體非負(fù)重關(guān)節(jié)的軟骨組織，切成1～2 mm的軟骨片，復(fù)合可生物降解的凝膠移植到軟骨缺損處修復(fù)缺損，將該技術(shù)稱(chēng)為第4代自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)。在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，DePuy Mitek公司制造了自體軟骨移植系統(tǒng)(cartilage autograft implantation system，CAIS)，經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)，該技術(shù)已應(yīng)用于臨床研究。Cole等[18]第1次將CAIS應(yīng)用于臨床研究，分別應(yīng)用自體軟骨移植和微骨折技術(shù)對(duì)29例膝關(guān)節(jié)軟骨缺損患者進(jìn)行治療，結(jié)果表明：在術(shù)后6個(gè)月、12個(gè)月，CAIS組膝關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)功能明顯好于微骨折組；術(shù)后24個(gè)月，磁共振檢查兩組缺損修復(fù)沒(méi)有明顯差異，但微骨折組有較多的骨贅生成。雖然CAIS移植取得了良好的修復(fù)效果，但CAIS移植面臨著供區(qū)移植組織受限和供區(qū)并發(fā)癥的缺點(diǎn)。后來(lái)，DePuy Mitek公司發(fā)起了大規(guī)模的臨床研究，但由于收錄注冊(cè)的患者數(shù)量不足以及資金問(wèn)題而沒(méi)有做長(zhǎng)期研究。現(xiàn)將4代ACI技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)歸納總結(jié)見(jiàn)表1。

3.2 成體干細(xì)胞移植 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有成軟骨分化能力，而且體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)具有旺盛的軟骨基質(zhì)分泌能力[19-20]。MSCs增殖能力較強(qiáng)，復(fù)合仿生支架材料后修復(fù)軟骨缺損效果較好。因此，MSCs曾被認(rèn)為是軟骨組織工程比較理想的種子細(xì)胞。但后來(lái)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，將MSCs分化來(lái)源的軟骨細(xì)胞體內(nèi)移植后會(huì)出現(xiàn)不同程度的鈣化現(xiàn)象，但出現(xiàn)鈣化的具體原因尚且沒(méi)有確切的結(jié)論，可能與細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后堿性磷酸酶以及X型膠原表達(dá)增多有關(guān)[21]。

表1 四代ACI技術(shù)比較

2002年，Wakitani等[22]將MSCs復(fù)合纖維蛋白凝膠治療創(chuàng)傷性膝關(guān)節(jié)炎，術(shù)后24個(gè)月關(guān)節(jié)鏡和組織學(xué)檢查結(jié)果證實(shí)，軟骨缺損被透明軟骨所修復(fù)，但遺憾的是患者的臨床癥狀并沒(méi)有得到明顯改善。Kuroda等[23]用MSCs復(fù)合I型膠原凝膠治療一位股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨缺損20 mm×30 mm的患者，術(shù)后7個(gè)月經(jīng)過(guò)關(guān)節(jié)鏡及組織學(xué)檢查證實(shí)，在缺損處有透明軟骨樣組織生成，術(shù)后1年患者膝關(guān)節(jié)功能明顯改善，無(wú)疼痛和并發(fā)癥發(fā)生，但是磁共振檢查結(jié)果顯示新生組織表面不規(guī)則。Nejadnik等[24]報(bào)道對(duì)72例膝關(guān)節(jié)軟骨缺損患者分別用MSCs移植和第1代自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)治療，術(shù)后隨訪(fǎng)兩組治療方法都可以改善患者膝關(guān)節(jié)癥狀，但兩種治療方法的治療結(jié)果沒(méi)有明顯差別。

MSCs雖然具備取材容易、分離簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但仍存在取材部位損傷、干細(xì)胞數(shù)量有限、形成的修復(fù)組織表面不平整等缺點(diǎn)，而且形成的類(lèi)透明軟骨組織與自體軟骨組織在生物力學(xué)性能上還有差距。雖然MSCs移植修復(fù)軟骨缺損在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用中還未發(fā)現(xiàn)有致瘤性，但這種可能還不能被排除，未來(lái)還需進(jìn)一步觀察和研究。

3.3 同種異體幼年軟骨微粒移植 近年來(lái)，同種異體幼年軟骨微粒移植已經(jīng)應(yīng)用于臨床研究，特別是在美國(guó)臨床中已經(jīng)取得重要進(jìn)展。該技術(shù)首先獲取捐贈(zèng)的13歲以下幼年關(guān)節(jié)軟骨，制作成1 mm×1 mm×1 mm的軟骨微粒備用，當(dāng)手術(shù)確診關(guān)節(jié)軟骨缺損后，可以一期將軟骨微粒復(fù)合仿生凝膠固定于軟骨缺損處，然后按計(jì)劃康復(fù)訓(xùn)練，該技術(shù)避免了細(xì)胞體外培養(yǎng)帶來(lái)的表型難以維持等缺陷。Zimmer公司隨后采用該策略開(kāi)發(fā)出軟骨修復(fù)移植物商品，即天然組織移植物商品(DeNovo natural tissue，DeNovo-NT)，該產(chǎn)品已經(jīng)應(yīng)用于美國(guó)臨床。Farr等[25]報(bào)道了前瞻性對(duì)照研究結(jié)果，結(jié)果顯示：術(shù)后患者的膝關(guān)節(jié)疼痛癥狀明顯緩解，運(yùn)動(dòng)功能明顯提高。對(duì)部分患者進(jìn)行關(guān)節(jié)鏡探查并取材分析，結(jié)論是初步療效滿(mǎn)意。Arshi等[26]和Buckwalter等[27]的近期研究也得出類(lèi)似的結(jié)論。Mcmillan等[28]報(bào)道了在全關(guān)節(jié)鏡下應(yīng)用幼年軟骨微粒修復(fù)全層股骨滑車(chē)缺損，該技術(shù)避免了傳統(tǒng)膝關(guān)節(jié)手術(shù)所引起的并發(fā)癥，但該技術(shù)缺少專(zhuān)門(mén)的工具能夠使移植物在缺損處分布均勻，而且移植材料或纖維蛋白凝膠有溶解可能。Kruse等[29]用同種異體幼年軟骨微粒治療1例踝關(guān)節(jié)軟骨缺損的患者，術(shù)后6個(gè)月踝關(guān)節(jié)已能完全活動(dòng)，術(shù)后24個(gè)月踝關(guān)節(jié)疼痛癥狀消失，缺損修復(fù)良好。Hatic等[30]、Saltzman等[31]的近期研究也得出相似的結(jié)論。同種異體幼年軟骨微粒也用于其他關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)，如肘關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)。Dunn等[32]報(bào)道了同種異體幼年軟骨微粒修復(fù)肘關(guān)節(jié)軟骨缺損，術(shù)后6個(gè)月隨訪(fǎng)，肘關(guān)節(jié)疼痛減輕，功能改善，MRI檢查顯示軟骨缺損得到修復(fù)。Pascual-Garrido等[33]報(bào)道了關(guān)節(jié)鏡下應(yīng)用同種異體幼年軟骨微粒修復(fù)髖關(guān)節(jié)軟骨缺損，術(shù)后12個(gè)月隨訪(fǎng)證實(shí)，髖關(guān)節(jié)活動(dòng)功能明顯改善，疼痛消失，軟骨缺損得到修復(fù)。有報(bào)道稱(chēng)同種異體幼年軟骨微粒移植對(duì)于中度的髖關(guān)節(jié)軟骨缺損(2～5 cm2)有較好的修復(fù)效果，但缺乏長(zhǎng)期的臨床追蹤報(bào)道結(jié)果，因此，還不能對(duì)其遠(yuǎn)期療效做出客觀評(píng)價(jià)。

該技術(shù)為異體來(lái)源組織，理論上存在疾病傳播、免疫排斥、移植物加工過(guò)程污染等風(fēng)險(xiǎn)，而且該技術(shù)的一些關(guān)鍵的修復(fù)機(jī)制尚待闡明，目前尚未見(jiàn)中國(guó)大陸應(yīng)用該技術(shù)修復(fù)軟骨缺損的研究報(bào)道。

3.4 應(yīng)用新型生物材料 隨著支架材料的深入研究，有研究者提出了用無(wú)細(xì)胞仿生支架修復(fù)軟骨缺損的新方法。2013年Schüettler等[34]通過(guò)關(guān)節(jié)鏡手術(shù)用無(wú)細(xì)胞的I型膠原支架治療1例膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的患者，術(shù)中患者軟骨下骨保存完整，術(shù)后42個(gè)月隨訪(fǎng)，患者膝關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)功能提高，疼痛癥狀消失，MRI顯示缺損得到修復(fù)。修復(fù)組織HE染色有軟骨細(xì)胞生成，新生組織免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示有新生的Ⅱ型膠原。后來(lái)，F(xiàn)ilardo等[35]報(bào)道用I型膠原和羥基磷灰石構(gòu)成的具有通透性的三維支架治療27例剝脫性骨軟骨炎的患者，術(shù)前采用開(kāi)放性手術(shù)暴露軟骨缺損并清除硬化的軟骨下骨，術(shù)后2年隨訪(fǎng)膝關(guān)節(jié)功能改善明顯，磁共振顯示軟骨缺損得到修復(fù)，但大部分患者有不均勻的再生組織和軟骨下骨的形態(tài)改變。Brix等[36]通過(guò)關(guān)節(jié)鏡手術(shù)用無(wú)細(xì)胞的納米支架治療8例膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的患者，術(shù)中清除部分軟骨下骨，術(shù)后分別于12、18、24個(gè)月進(jìn)行隨訪(fǎng)，有7例患者無(wú)細(xì)胞支架與周?chē)峭耆希?例患者有軟骨下骨化，磁共振檢查結(jié)果顯示修復(fù)組織并非是透明軟骨樣組織。

新型生物材料的應(yīng)用避免了細(xì)胞提取、分離的復(fù)雜步驟，避免了軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)表型不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，為臨床修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損提供了新思路和新方法。然而，該技術(shù)修復(fù)軟骨缺損有軟骨修復(fù)不全、軟骨形態(tài)改變和骨贅形成等缺點(diǎn)，這些缺點(diǎn)導(dǎo)致該技術(shù)未能在臨床進(jìn)一步推廣應(yīng)用。單純的支架材料，其成軟骨修復(fù)活性往往不足，還不能很好的滿(mǎn)足臨床需求，有基礎(chǔ)研究提示復(fù)合生長(zhǎng)因子后可提高軟骨修復(fù)能力，但是有關(guān)該技術(shù)臨床的有效性及安全性尚未知曉。

4 臨床應(yīng)用進(jìn)展

目前文獻(xiàn)報(bào)道的主要治療關(guān)節(jié)是膝關(guān)節(jié)，Siebold等[37]將自體關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)形成三維微球體，然后移植于30例患者軟骨缺損處，術(shù)后進(jìn)行隨訪(fǎng)，86.6%的患者生活質(zhì)量得到明顯提高，疼痛減輕，膝關(guān)節(jié)功能改善，Mocart評(píng)分和磁共振影像證實(shí)膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性良好。Mumme等[38]第1次將人的自體鼻軟骨細(xì)胞用于膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的治療，他們將體外再生成軟骨能力更好的鼻軟骨細(xì)胞復(fù)合于膠原支架上，然后移植于25例患者膝關(guān)節(jié)軟骨缺損處，術(shù)后24個(gè)月隨訪(fǎng)，患者疼痛癥狀減輕，膝關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)功能明顯提高，新生的軟骨組織結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)性能接近于正常組織。該實(shí)驗(yàn)還需對(duì)其遠(yuǎn)期療效做進(jìn)一步觀察，觀察是否能夠抑制或消除骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。踝關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)有少數(shù)報(bào)道，Dunn等[32]、Pascual-Garrido等[33]也報(bào)道了肘關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)結(jié)果。

5 展 望

軟骨組織工程技術(shù)應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨缺損雖然僅有短短30余年，但已展現(xiàn)出廣闊的臨床應(yīng)用前景。近年來(lái)，隨著再生醫(yī)學(xué)、材料學(xué)以及生物化學(xué)的迅速發(fā)展，組織工程技術(shù)已從基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)化應(yīng)用到臨床。傳統(tǒng)的治療方法雖能改善癥狀，但并不能形成組織結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)性能類(lèi)似于透明軟骨的組織。應(yīng)用組織工程技術(shù)不僅能夠明顯改善癥狀，而且能夠形成透明軟骨樣組織，其生物力學(xué)性能接近于自體軟骨組織。然而，還要認(rèn)識(shí)到該技術(shù)目前所面臨的問(wèn)題，例如：a)自體軟骨來(lái)源受限、供區(qū)不穩(wěn)、供區(qū)并發(fā)癥；b)軟骨細(xì)胞體外擴(kuò)增，表型不穩(wěn)定出現(xiàn)肥大化；c)支架材料存在機(jī)械強(qiáng)度和組織誘導(dǎo)活性不足；d)組織界面整合欠佳；e)遠(yuǎn)期觀察新生組織容易退變等[12]。因此，未來(lái)還需進(jìn)一步探討種子細(xì)胞、支架材料以及體內(nèi)修復(fù)機(jī)制等。一旦以上關(guān)鍵問(wèn)題得到解決，該技術(shù)將會(huì)很快在臨床得到推廣和普及。

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