索倉平，葉永杰

(四川省遂寧市中心醫(yī)院骨外科，四川 遂寧 629000)

血小板活化因子(platelet-activating factor，PAF)是一種具有廣泛的生物學(xué)活性的脂質(zhì)遞質(zhì)，可通過對PAF受體介導(dǎo)血小板功能改變而參與許多臨床疾病發(fā)生發(fā)展，也是判斷某些臨床疾病的實驗室參考指標(biāo)[1]。膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種以退行性病理改變?yōu)榛A(chǔ)的常見慢性的關(guān)節(jié)疾病，嚴(yán)重影響關(guān)節(jié)功能，降低生活質(zhì)量，尚無有效的診斷及預(yù)后觀察的實驗室指標(biāo)[2]。PAF水平及血小板參數(shù)變化是否能作為膝骨關(guān)節(jié)炎診斷及預(yù)后觀察的實驗室指標(biāo)尚待研究。本文擬通過觀察膝骨關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)治療前后PAF水平及血小板參數(shù)變化，探討其在膝骨關(guān)節(jié)炎中的作用及其在臨床應(yīng)用中作為診斷及預(yù)后觀察指標(biāo)的價值。

1 資料與方法

1.1 主要試劑及儀器 五分類血細(xì)胞計數(shù)儀CD3200購自雅培公司；PAF檢測試劑購自上海酶聯(lián)公司。

1.2 一般資料 研究對象為2014年10月至2014年12月在我科治療的膝骨關(guān)節(jié)炎患者96例，男56例，年齡40.8～67.5歲，平均(51.5±11.3)歲；女40例，年齡38.5～63.2歲，平均(48.9±10.1)歲。所有患者均排除肝腎、心臟疾病，高血脂、高血壓，結(jié)締組織、內(nèi)分泌及腫瘤疾病。

治療組為以上96例膝關(guān)節(jié)置換術(shù)1年后患者48例，其中男28例，年齡40.8～62.8歲，平均(51.5±11.2)歲；女20例，年齡38.6～63.2歲，平均(48.9±10.4)歲。同時排斥術(shù)后并發(fā)癥及新發(fā)疾病。疾病組為以上96例中未做膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者48例，其中男28例，年齡44.3～67.5歲，平均(49.5±10.3)歲；女20例，年齡38.5～59.2歲，平均(42.9±11.2)歲。正常對照組20例，其中男12例，年齡38.0～63.7歲，平均(49.5±10.9)歲；女8例，年齡40.9～65.8，平均(50.5±9.2)歲；均無膝關(guān)節(jié)及上述疾病。膝骨關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)美國風(fēng)濕病學(xué)會膝骨關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)(1995版)[3]。根據(jù)研究目的分為患者組、治療組和正常對照組，所有臨床標(biāo)本采集均取得患者知情同意。關(guān)于三組患者的性別及年齡等因素的分析，P>0.05，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

1.3 血小板參數(shù)測定 測定前校準(zhǔn)儀器，患者及正常對照組安靜狀態(tài)下取血2.0 mL即刻EDTA-Na充分混勻抗凝，30 min內(nèi)五分類血細(xì)胞計數(shù)儀CD3200測定。

1.4 血清PAF含量測定 全血室溫凝固，3 000 r/min，離心10 min，取上清。ELISA法檢測血清PAF含量，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔及空白孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL。樣本孔先加待測樣本50 μL，再加樣本稀釋液50 μL，空白孔不加。除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入酶標(biāo)抗體100 μL，37℃溫育30 min，棄去液體，拍干，每孔加洗滌液，靜置1 min，甩干，洗板5次，每孔分別加入底物A和B各50μL，37℃避光孵育15 min。每孔加終止液50 μL，15 min內(nèi)，450 nm波長處測定各孔的OD值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算PAF含量。

表1 三組人群的一般信息比較

1.5 關(guān)節(jié)液PAF含量測定 經(jīng)患者同意后，用2 mL一次性注射器抽取患者關(guān)節(jié)腔液體0.5 mL左右并迅速注入含有肝素鈉抗凝的無菌試管內(nèi)，3 000 r/min離心10 min，取上清。ELISA法檢測血清PAF含量(方法同1.4)。

2 結(jié) 果

2.1 全血血小板各參數(shù)指標(biāo)測定 與正常組比較，膝關(guān)節(jié)炎疾病組血小板平均體積(mean platelet volume，MPV)、血小板壓積(plateletcrit，PCT)及血小板分布寬度(platelet distribution width，PDW)輕度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療后MPV、PCT及PDW幾乎下降到正常水平，與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與疾病組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；血小板(platelet，PLT)在三組中比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

正常組、膝關(guān)節(jié)炎疾病組及關(guān)節(jié)置換術(shù)后治療組血小板各參數(shù)指標(biāo)進(jìn)行測定并對測定結(jié)果作相關(guān)分析。MPV與PCT相關(guān)系數(shù)r為0.84(P=0.00)，MPV與PDW相關(guān)系數(shù)r為0.98(P=0.00)，MPV與PLT相關(guān)系數(shù)r為0.001(P=0.00)；PCT與PDW相關(guān)系數(shù)r為0.64(P=0.00)，PCT與PLT相關(guān)系數(shù)r為0.002(P=0.00)；PDW與PLT相關(guān)系數(shù)r為0.001(P=0.00)，MPV、PCT及PDW三者之間存在線性相關(guān)關(guān)系，與PLT不存在線性相關(guān)關(guān)系。

各分組與血小板參數(shù)做相關(guān)分析求r值，三組與MPV的r值分別為0.001、0.64、0.001(P=0.00)；與PCT的r值分別為0.001、0.52、0.001(P=0.00)；與PDW的r值分別為0.001、0.58、0.001(P=0.00)，以上參數(shù)僅與疾病組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與PLT的r值分別為0.001、0.001、0.001(P=0.00)，其與各組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2～3。

以MPV、PCT、PDW、PLT、血清PAF及關(guān)節(jié)液PAF為自變量，以膝骨關(guān)節(jié)炎為因變量，行多因素Logistic回歸分析，MPV、PCT、PDW、血清PAF及關(guān)節(jié)液PAF是膝骨關(guān)節(jié)炎的獨立危險因素，統(tǒng)計學(xué)方法分析P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見表4。

表2 三組血小板參數(shù)比較

表3 三組血小板參數(shù)的r值比較

2.2 血清及關(guān)節(jié)液PAF含量測定 與正常組比較，疾病組血清及關(guān)節(jié)液PAF含量分別為其6.7倍和7.0倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后，PAF含量分別下降其5.6倍和6.1倍，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各分組與血清及關(guān)節(jié)液PAF做相關(guān)分析求r值，僅疾病組與PAF有相關(guān)性，血清r值0.78，關(guān)節(jié)液r值0.82(P=0.00)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

繪制ROC曲線，計算AUCROC，AUCROC(MPV)=0.77 ，AUCROC(PCT)=0.74，AUCROC(PDW)=0.77，AUCROC(血清PAF)=0.86，AUCROC(關(guān)節(jié)液PAF)=0.87，見圖2。相關(guān)分析的散點圖見圖3。

3 討 論

膝關(guān)節(jié)炎是一種以退行性病理改變?yōu)榛A(chǔ)的疾病，主要病理改變是關(guān)節(jié)軟骨的退行性變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生，其診斷目前多依賴影像學(xué)檢查，但敏感性較差，出現(xiàn)影像學(xué)征象時往往已經(jīng)開始出現(xiàn)骨質(zhì)破壞以及增生[4]。很多研究發(fā)現(xiàn)某些實驗室檢查可在影像學(xué)征象出現(xiàn)前對其早期診斷，積極地治療后可以提高患者的生活質(zhì)量。目前檢測血液及關(guān)節(jié)液相應(yīng)的各種酶類及細(xì)胞因子等是膝骨關(guān)節(jié)炎實驗室診斷研究，特別是對關(guān)節(jié)組織內(nèi)蛋白酶及活性因子的研究是當(dāng)今的熱點[5]。PAF是近年來發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性脂類介質(zhì)，在血栓形成、急性炎癥、哮喘、過敏反應(yīng)、休克、風(fēng)濕病、移植排斥、凋亡等病理生理過程中起重要作用，也有研究發(fā)現(xiàn)血小板參數(shù)在各種臨床疾病中會發(fā)生改變，可以為疾病的診斷及預(yù)后提供科學(xué)的依據(jù)[6]，但是PAF含量及血小板參數(shù)在膝骨關(guān)節(jié)炎的診斷價值研究并不明確。因此，本研究通過觀察正常人群、膝骨關(guān)節(jié)炎患者并對患者進(jìn)行骨關(guān)節(jié)置換術(shù)治療，同時檢測PAF含量及血小板參數(shù)，推測PAF含量改變及血小板參數(shù)變化在膝骨關(guān)節(jié)炎中的診斷價值。研究結(jié)果顯示，PAF、MPV、PCT及PDW與膝骨關(guān)節(jié)炎存在相關(guān)性，有可能成為骨關(guān)節(jié)炎臨床診斷及預(yù)后觀察的實驗室指標(biāo)。

PAF可由內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生并參與血小板等眾多細(xì)胞的活化聚集，并在細(xì)胞脫顆粒、釋放氧自由基、增加血管通透性和誘發(fā)炎癥反應(yīng)等多種病理生理過程中起重要作用[7]。在生理狀態(tài)下，軟骨細(xì)胞合成與分解代謝之間保持平衡并調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)與其功能，在膝骨關(guān)節(jié)炎患者中由于細(xì)胞因子表達(dá)失控而使軟骨細(xì)胞合成與分解代謝失去平衡，促進(jìn)多種細(xì)胞因子由滑液、滑膜及軟骨細(xì)胞釋放從而加重膝關(guān)節(jié)炎的損害[8]。本實驗中，對照組和治療組均未檢測到高濃度的PAF，而膝骨關(guān)節(jié)炎患者的血清和關(guān)節(jié)液中卻可以檢測到高濃度的PAF，表明在骨關(guān)節(jié)炎患者骨質(zhì)破壞后可能在骨組織的局部產(chǎn)生PAF并沿著破壞的骨質(zhì)釋放到關(guān)節(jié)液和血液中，PAF與膝骨關(guān)節(jié)炎存在因果關(guān)系，具有成為診斷及判斷膝骨關(guān)節(jié)炎預(yù)后的實驗室診斷指標(biāo)。

圖1 血小板活化因子含量的測定

相關(guān)因素回歸系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤檢驗的統(tǒng)計量P值優(yōu)勢比(95%CI)可信區(qū)間(95%CI)血小板平均體積(fL)0.4350.33816.182<0.051.676(1.43,2.27)血小板壓積(%)0.5620.41914.314<0.051.481(1.33,2.25)血小板分布寬度(fL)0.5810.47714.416<0.051.676(1.23,2.11)血小板(×109/L)0.5680.22313.092>0.050.978(0.78,1.57)血清中血小板活化因子(μg/L)0.6290.44613.562<0.051.856(1.28,3.09)關(guān)節(jié)液中血小板活化因子(μg/L)0.7480.46316.204<0.052.568(1.35,5.24)

a 血小板平均體積 b 血小板壓積 c 血小板分布寬度

d 血清中血小板活化因子 e 關(guān)節(jié)液中血小板活化因子

圖2 不同相關(guān)因素的ROC曲線

a 血小板平均體積 b 血小板壓積 c 血小板分布寬度

d 血清中血小板活化因子 e 關(guān)節(jié)液中血小板活化因子

圖3 不同相關(guān)因素的散點圖

研究發(fā)現(xiàn)，PAF是迄今發(fā)現(xiàn)的最強的血小板聚集誘導(dǎo)劑和炎癥因子，可以通過多種途徑引起血小板參數(shù)發(fā)生變化[9]。MPV是指每個血小板的平均體積，反映細(xì)胞增生及血小板生成的參數(shù)，也是血小板活化的生物學(xué)指標(biāo)，可用于估計血小板的功能狀態(tài)，結(jié)合血小板數(shù)當(dāng)MPV增大可作為骨髓造血功能恢復(fù)的早期指標(biāo)，同時局部炎癥時MPV可以正?；蛟龃骩10]。PDW是反映血小板體積差異程度的參數(shù)，血小板大小或體積差異一方面反映骨髓中巨核細(xì)胞的增生、代謝及血小板生成狀態(tài)，體積大的血小板為年輕的血小板，隨著成長體積逐漸變??；另一方面也提示血小板的年齡及功能，當(dāng)血小板受機體內(nèi)各種炎癥因子作用后可發(fā)生形態(tài)與功能的改變從而引起PDW的改變[11]。PCT反映血小板占全血的體積百分比，PCT與MPV呈正相關(guān)，MPV的增減均可使PCT發(fā)生變化，受血小板數(shù)量及大小的影響，PCT的變化一般與血小板數(shù)量變化相一致[12]。PLT也是骨髓造血功能的指標(biāo)，某些炎癥因子可以引起造血微環(huán)境改變進(jìn)而引起PLT數(shù)量的改變，但一般只有骨髓造血微環(huán)境受到嚴(yán)重影響其數(shù)值才會發(fā)生變化[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)炎患者發(fā)病時，血小板的MPV、PCT及PDW三個參數(shù)均升高，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；當(dāng)膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后3個參數(shù)均下降到正常水平，而PLT則無明顯變化，可以推測膝骨關(guān)節(jié)炎炎癥介質(zhì)是由局部破壞的骨組織引起的炎癥反應(yīng)而引起某些細(xì)胞因子合成增多并釋放入血從而影響骨髓造血功能輕度改變卻不足以引起PLT數(shù)量發(fā)生改變。由此可以推測，PAF是可能通過膝關(guān)節(jié)局部炎癥介質(zhì)作用及在血液中對骨髓造血功能的影響從而引起血小板參數(shù)的變化，血小板參數(shù)的變化同樣與膝骨關(guān)節(jié)炎存在因果關(guān)系，具有成為診斷及判斷膝骨關(guān)節(jié)炎預(yù)后的實驗室診斷指標(biāo)的潛在能力。

綜上所述，PAF、MPV、PCT及PDW與膝骨關(guān)節(jié)炎存在相關(guān)關(guān)系，可作為臨床診斷及預(yù)后判斷的實驗室診斷指標(biāo)之一，但與膝骨關(guān)節(jié)炎的病情與病程的相關(guān)程度及能否成為早期風(fēng)險預(yù)測因子有待進(jìn)一步研究。

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