任 昊，李麗芳，王彥美，黃 楠，裴芳櫻，李嘉威，孫耀貴，段智變，李宏全，王文魁*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院環(huán)境科學(xué)與食品工程系，太谷 030801；3.濱州學(xué)院生物工程學(xué)院，濱州 256600)

肉雞肺動脈高壓綜合征(pulmonary hypertension syndrome, PHS)，又稱腹水綜合征(ascites syndrome, AS)，作為嚴(yán)重影響肉雞養(yǎng)殖業(yè)的重要代謝性疾病，一直以來備受養(yǎng)雞從業(yè)者和科學(xué)研究者的高度重視。AS屬代謝綜合征，其發(fā)生發(fā)展涉及多因素、多層次、多環(huán)節(jié)，以往的研究主要集中于缺氧引起肺動脈高壓這一中心環(huán)節(jié)[1-4]，部分解釋了本病的發(fā)生發(fā)展過程，尚不能完全揭示其發(fā)病機(jī)制。右心肥大是該綜合征的顯著特征[5-6]，闡明右心肥大的發(fā)生發(fā)展，從另一視角審視肉雞腹水綜合征，無疑有利于全面揭示本病的發(fā)病機(jī)制。

心力衰竭及心臟肥大過程中腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated kinase, AMPK)激活，一方面，AMPK依賴性磷酸化6-磷酸果糖激酶被激活，促進(jìn)糖酵解，生成更多ATP，滿足心肌能量代謝需求[7-8]；另一方面，AMPK通過激活脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(fatty acid translocase, FAT/CD36)進(jìn)而促進(jìn)心肌攝取游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)，并通過磷酸化乙酰輔酶A抑制其向丙二酰輔酶A(malonyl-CoA)轉(zhuǎn)化，從而增強(qiáng)心肌對脂肪酸的利用[9-10]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，AS患病肉雞心臟巨噬細(xì)胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory, MIF)表達(dá)量顯著高于健康對照雞。哺乳動物研究資料提示，MIF在心肌缺血、缺氧等應(yīng)激反應(yīng)過程中通過激活A(yù)MPK參與心肌能量代謝調(diào)節(jié)，對心臟生理活動和病理變化具有重要作用[11-12]。為了確認(rèn)MIF是否通過激活A(yù)MPK參與雞心肌細(xì)胞脂肪酸代謝調(diào)節(jié)，我們開展了此項(xiàng)研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

9～12日齡AA肉雞雞胚，購自山西康牧種雞場。

1.2 主要試劑

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)用試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基(SH30022.01，HyClone)、新生牛血清(16010-159，Gibco)、P/S雙抗青鏈霉素(PAA)、0.25%胰蛋白酶(25200-056，Sigma)、膠原酶Ⅱ(C8150，Solarbio)。氯化鈷(C8661，Sigma)、ISO-1(Ab142140，Abcam)。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)試驗(yàn)用試劑 4%多聚甲醛溶液(Solarbio)、Triton X-100(Solarbio)、α-Sarcomeric actin(BM0001，Boster)、SABC-POD(小鼠IgG)試劑盒(SA1021，Boster)、羊抗鼠IgG-HRP(Boster)、蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(Solarbio)、DAB顯色試劑盒(AR1022，Boster)

1.2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡用試劑 除兔抗雞MIF多抗為實(shí)驗(yàn)室自制外，其他均為商品化多克隆抗體：HIF-1α(D262108，BBI)、AMPK(bs-1115R，Bioss)、p-AMPK(2531，Cell Signaling)、FAT/CD36(D161529，BBI)、ACC(D155300，BBI)、p-ACC(D155180，BBI)、CPT-1A(bs-2047R，Bioss)。羊抗兔IgG-HRP二抗(Bioss)，RIPA裂解液(Beyotime)，4×蛋白質(zhì)上樣緩沖液(Solarbio)。

1.3 方法

1.3.1 雞胚心肌細(xì)胞分離培養(yǎng) 根據(jù)P. Simpson等的方法適當(dāng)改進(jìn)[13]。取孵化9～12日齡肉雞蛋，用75%酒精消毒蛋殼后轉(zhuǎn)入超凈工作臺，進(jìn)行無菌操作：取出雞胚，暴露胸腔，摘取心放入預(yù)冷的無鈣、鎂PBS緩沖液，吹打清洗，剔除心冠脂肪血管等組織； PBS緩沖液(無鈣、鎂)漂洗3次后剪成直徑約1 mm大小的組織塊，再用PBS緩沖液(無鈣、鎂)漂洗3次。加入0.08%胰蛋白酶溶液，37 ℃恒溫振蕩消化，大約5 min后棄上清液，再加0.125%胰蛋白酶與0.1% Ⅱ型膠原酶(等量混合)，37 ℃靜置消化8 min，加10%新生牛血清DMEM高糖液體培養(yǎng)液終止消化，如此重復(fù)消化數(shù)次，直至組織塊呈絮狀半透明樣為止。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，去除細(xì)胞團(tuán)塊，常溫1 000 r·min-1離心8 min，棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸，移入30 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，常規(guī)(37 ℃、5% CO2)培養(yǎng)40 min除成纖維細(xì)胞，再以1×106·mL-1接種于6孔培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)，并分別于18、42 h更換培養(yǎng)液。

1.3.2 心肌細(xì)胞形態(tài)機(jī)能觀察 細(xì)胞培養(yǎng)至24、48 h時，倒置顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞生長情況及自主搏動頻率、強(qiáng)度，進(jìn)行拍照、錄像。

1.3.3 免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定 采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定心肌細(xì)胞。將培養(yǎng)48 h的細(xì)胞爬片用預(yù)冷PBS清洗3次，4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15 min，再用0.5% Triton X-100細(xì)胞通透劑處理30 min；接著按即用型SABC-POD試劑盒說明進(jìn)行操作：10% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，5% BSA封閉，一抗(1∶300)4 ℃濕盒孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，DAB顯色(黃)。稀釋液PBS作陰性對照。

1.3.4 心肌細(xì)胞化學(xué)性缺氧模型的建立 24 h培養(yǎng)良好的心肌細(xì)胞，換無血清DMEM高糖培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)8～12 h，細(xì)胞呈現(xiàn)同步化搏動時開始建模。試驗(yàn)組給予不同濃度(400、500、600和700 μmol·L-1)氯化鈷，正常對照組加入無血清培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，摸索化學(xué)性缺氧最佳條件。

1.3.5 MIF阻斷試驗(yàn) 在缺氧的同時，試驗(yàn)組給予不同濃度(10、50和100 μmol·L-1)MIF阻斷劑(ISO-1)，正常對照組加入無血清培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，觀察ISO-1對MIF的阻斷效果。

2 結(jié) 果

2.1 原代雞胚心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)及機(jī)能活動觀察

剛分離消化的心肌細(xì)胞呈類圓形，懸浮于培養(yǎng)液中；培養(yǎng)24 h后細(xì)胞大分部貼壁，呈梭形、不規(guī)則形，立體感明顯且具較強(qiáng)折光性(圖1A)，細(xì)胞搏動明顯，但節(jié)律不一致，30～60次·min-1；48 h后心肌細(xì)胞伸出偽足相互接觸交聯(lián)成網(wǎng)狀(圖1B)，收縮明顯而有力，出現(xiàn)同步搏動，節(jié)律80～130次·min-1。

A.培養(yǎng)24 h；B.培養(yǎng)48 hA. Cardiomyocytes cultured for 24 hours；B. Cardiomyocytes cultured for 48 hours圖1 光鏡下原代雞胚心肌細(xì)胞(200×)Fig.1 Primary chicken embryonic cardiomyocytes in vivo (200×)

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定

免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，陽性組心肌細(xì)胞核藍(lán)染，細(xì)胞質(zhì)充滿細(xì)小均勻的棕黃色絲狀結(jié)構(gòu)，心肌細(xì)胞占90%以上(圖2A)；陰性對照組以PBS替代一抗，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)未見棕黃色肌絲結(jié)構(gòu)(圖2B)。

2.3 心肌細(xì)胞缺氧模型的構(gòu)建

Western blot檢測結(jié)果顯示(圖3、表1)，與正常組相比，600 μmol·L-1氯化鈷處理組HIF-1ɑ和MIF蛋白表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)。

2.4 ISO-1阻斷MIF試驗(yàn)

Western blot檢測結(jié)果顯示(圖4、表2)，與正常組相比，氯化鈷處理組MIF及p-AMPK蛋白表達(dá)量均極顯著升高(P<0.01)；與氯化鈷處理組相比，ISO-100 μmol·L-1阻斷組MIF及p-AMPK蛋白表達(dá)量均極顯著降低(P<0.01)。

A. 陽性染色組；B. 陰性對照組A. Positive staining group incubated with α-sarcomeric actin；B. Negative control with PBS圖2 原代雞胚心肌免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定(400×)Fig.2 The chicken embryonic cardiomyocytes incubated with α-sarcomeric actin (400×)

0、400、500、600和700 μmol·L-1氯化鈷處理雞胚心肌細(xì)胞24 h HIF-1α及MIF的免疫印跡The chicken embryonic cardiomyocytes were treated with 0, 400, 500, 600 or 700 μmol·L-1 CoCl2 for 24 h, and the expression levels of HIF-1α and MIF were determined by Western blot圖3 氯化鈷處理的雞胚心肌細(xì)胞HIF-1α、MIF表達(dá)變化Fig.3 Effects of cobalt chloride on the expression of HIF-1α, MIF in the chicken embryonic cardiomyocytes

表1經(jīng)氯化鈷處理雞胚心肌細(xì)胞HIF-1α、MIF表達(dá)量

Table1ExpressionofHIF-1αandMIFinthecardiomyocytestreatedwithCoCl2

目的蛋白質(zhì)Targetprotein對照組Controlgroup氯化鈷組CoCl2group400μmol·L-1500μmol·L-1600μmol·L-1700μmol·L-1HIF-1α11.167±0.007*1.537±0.010**1.721±0.021**1.243±0.019*MIF11.235±0.0152.085±0.075**4.492±0.071**2.931±0.004**

與對照組相比，*.P<0.05；**.P<0.01

Compared with the control group,*.P<0.05;**.P<0.01

0、10、50和100 μmol·L-1 ISO-1處理雞胚心肌細(xì)胞24 h，MIF及p-AMPK免疫印跡The chicken embryonic cardiomyocytes were treated with 0, 10, 50 and 100 μmol·L-1 ISO-1 for 24 h, and the expression levels of MIF and p-AMPK were determined by Western blot圖4 ISO-1處理雞胚心肌細(xì)胞24 h后其MIF、p-AMPK表達(dá)變化Fig.4 Effects of ISO-1 on the expression of MIF and p-AMPK in the chicken embryonic cardiomyocytes

表2ISO-1處理雞胚心肌細(xì)胞MIF、p-AMPK表達(dá)量

Table2ExpressionofMIFandp-AMPKinthecardiomyocytestreatedwithISO-1

目的蛋白質(zhì)Targetprotein對照組Controlgroup氯化鈷組CoCl2groupCoCl2+ISO組CoCl2+ISOgroupCoCl2+10μmol·L-1ISOCoCl2+50μmol·L-1ISOCoCl2+100μmol·L-1ISOMIF13.835±0.105**3.232±0.089#2.985±0.053##2.880±0.080##p-AMPK11.668±0.087**1.414±0.0041.208±0.055#1.083±0.083##

與對照組相比，*.P<0.05；**.P<0.01。與氯化鈷組相比，#.P<0.05;##.P<0.01

Compared with the control group,*.P<0.05;**.P<0.01. Compared with the CoCl2group,#.P<0.05;##.P<0.01

2.5 缺氧狀態(tài)下雞胚心肌細(xì)胞脂肪酸代謝途徑關(guān)鍵蛋白質(zhì)的變化

HIF-1α、MIF、FAT/CD36和CPT-1A均以β-actin為內(nèi)參，p-AMPK以AMPK和β-actin為內(nèi)參，p-ACC以總ACC和β-actin為內(nèi)參。Western blot檢測結(jié)果顯示(圖5、表3)，與對照組相比，缺氧組雞胚心肌細(xì)胞HIF-1α、MIF、FAT/CD36、CPT-1A及磷酸化p-AMPK和p-ACC表達(dá)量極顯著增多(P<0.01)。

圖5 缺氧狀態(tài)下雞胚心肌細(xì)胞HIF-1α、MIF、p-AMPK、FAT/CD36、p-ACC、CPT-1A表達(dá)的免疫印跡分析Fig.5 The Western blot analysis of HIF-1α、MIF、p-AMPK、FAT/CD36、p-ACC and CPT-1A in chicken embryonic cardiomyocytes in hypoxia

表3缺氧狀態(tài)下雞胚心肌細(xì)胞脂肪酸代謝途徑關(guān)鍵蛋白質(zhì)的變化

Table3Theexpressionlevelsofthekeyproteinsoffattyacidmetabolicpathwayinchickenembryoniccardiomyocytesinhypoxia

目的蛋白質(zhì)Targetprotein對照組Controlgroup氯化鈷組CoCl2groupHIF-1α0.993±0.0341.176±0.021**MIF1.000±0.0471.731±0.167**p-AMPK1.053±0.0491.753±0.104**FAT/CD361.057±0.0531.905±0.052**p-ACC1.140±0.1443.901±0.163**CPT-1A1.074±0.1222.844±0.253**

與對照組相比，*.P<0.05；**.P<0.01

Compared with the control group,*.P<0.05;**.P<0.01

2.6 阻斷MIF后各目的蛋白質(zhì)在雞胚心肌中的表達(dá)變化

Western blot檢測結(jié)果顯示(圖6、表4)，與缺氧組相比，ISO-1阻斷組雞胚心肌細(xì)胞MIF、FAT/CD36、CPT-1A及磷酸化p-AMPK和p-ACC表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)。

圖6 ISO-1處理后缺氧雞胚心肌細(xì)胞MIF、p-AMPK、FAT/CD36、p-ACC、CPT-1A表達(dá)的免疫印跡分析Fig.6 The Western blot analysis of MIF、p-AMPK、FAT/CD36、p-ACC and CPT-1A in chicken embryonic cardiomyocytes treated with ISO-1 in hypoxia

3 討 論

肉雞腹水綜合征這一代謝性疾病嚴(yán)重影響著養(yǎng)雞業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和雞肉品質(zhì)，目前認(rèn)為缺氧是導(dǎo)致肉雞發(fā)生AS的主要原因[14-15]。肉雞生長快，心肺功能相對較弱，這是造成機(jī)體相對缺氧或絕對缺氧的先天因素；飼養(yǎng)管理不當(dāng)、環(huán)境氣候變化、營養(yǎng)失調(diào)、罹患其他疾病等造成機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，加劇缺氧，引起肺動脈重構(gòu)，肺循環(huán)阻力增大，使處于“能量饑餓”的心臟，特別是右心，代償性肥大[16-17]。

為了探討缺氧對心肌能量代謝的影響，我們首先建立了肉雞雞胚心肌細(xì)胞缺氧模型。獲得高純度、高活力的雞胚心肌細(xì)胞是本研究的基礎(chǔ)。結(jié)果

表4ISO-1處理后缺氧雞胚心肌細(xì)胞脂肪酸代謝途徑關(guān)鍵蛋白質(zhì)的變化

Table4TheexpressionlevelsofthekeyproteinsoffattyacidmetabolicpathwayinchickenembryoniccardiomyocytestreatedwithISO-1inhypoxia

目的蛋白質(zhì)Targetprotein對照組Controlgroup氯化鈷組CoCl2group抑制劑組ISOgroupMIF1.005±0.0053.995±0.222**2.847±0.295##p-AMPK0.995±0.0052.361±0.124**1.446±0.034##FAT/CD360.830±0.1701.676±0.040**1.039±0.050##p-ACC0.885±0.1152.359±0.038**1.087±0.189##CPT-1A0.975±0.0253.760±0.090**2.605±0.045##

與對照組相比，*.P<0.05；**.P<0.01。與氯化鈷組相比，#.P<0.05;##.P<0.01

Compared with the control group,*.P<0.05;**.P<0.01. Compared with the CoCl2group,#.P<0.05;##.P<0.01

顯示(圖1、2)，免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定及心肌特有功能(自律性搏動)均確認(rèn)，采用含10%新生牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)雞胚心肌細(xì)胞獲得成功，其搏動頻率在80～130次·min-1。

氯化鈷作為一種化學(xué)缺氧模擬劑，其二價鈷通過競爭二價鐵抑制脯氨酸羥化酶的活性，提高HIF-1α的穩(wěn)定性，促進(jìn)HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性，使常氧條件下低氧反應(yīng)元件調(diào)控的基因得以轉(zhuǎn)錄表達(dá)[18-20]。筆者的研究結(jié)果顯示(圖3)，400～700 μmol·L-1CoCl2作用24 h時HIF-1α表達(dá)顯著增加，且二者在400～600 μmol·L-1CoCl2間呈正相關(guān)，CoCl2濃度再增大(700 μmol·L-1)時，HIF-1α表達(dá)量反下降。提示600 μmol·L-1CoCl2處理心肌細(xì)胞24 h，可獲得良好的體外培養(yǎng)細(xì)胞缺氧模型。

S. M. Welford等研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α能與MIF啟動子區(qū)域特異性低氧反應(yīng)原件(HRE)結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控MIF的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[21]。圖3表明，CoCl2濃度在400～700 μmol·L-1范圍內(nèi)，雞胚心肌細(xì)胞HIF-1α和MIF的表達(dá)具有相同變化趨勢，在400～600 μmol·L-1間二者表達(dá)量逐漸增大，增至700 μmol·L-1時二者表達(dá)量均下降。這種高度擬合的變化趨勢充分佐證，雞MIF基因同樣具有低氧反應(yīng)元件，其轉(zhuǎn)錄表達(dá)受HIF-1α調(diào)控。

AMPK作為細(xì)胞的“能量感受器”，在細(xì)胞能量代謝中扮演著“總開關(guān)”的作用[22-24]。心臟缺血再灌注損傷時引起心肌自分泌MIF，通過激活A(yù)MPK，改善其能量代謝[25-26]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)[27]，AS患病肉雞心臟組織MIF、p-AMPK表達(dá)量均顯著高于正常肉雞，猜測缺氧時MIF、p-AMPK與腹水的發(fā)生有關(guān)。試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖4)，缺氧時心肌MIF表達(dá)增多、AMPK活化增強(qiáng)；ISO處理缺氧心肌細(xì)胞后，MIF表達(dá)減少、AMPK活化降低。這種現(xiàn)象提示：缺氧時雞心肌細(xì)胞自分泌MIF增多，后者通過激活A(yù)MPK調(diào)節(jié)心肌能量代謝。心肌主要依賴脂肪酸供能(占心肌總耗能的60%～90%)[28]，我們利用Western bolt檢測了缺氧雞胚心肌細(xì)胞脂肪酸代謝途徑關(guān)鍵蛋白的變化(圖5、6)，缺氧時FAT/CD36、磷酸化乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase, p-ACC)和肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(carnitine palmitoyltransferase 1, CPT-1A)的蛋白質(zhì)表達(dá)增加；ISO阻斷MIF后這三種蛋白表達(dá)均顯著降低。由此推斷，活化的AMPK一方面激活FAT/CD36，促進(jìn)脂肪酸跨細(xì)胞膜向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)；另一方面磷酸化ACC使其失活，從而阻止丙二酰輔酶A形成，解除丙二酰輔酶A對CPT-1A的抑制，加速脂酰輔酶A(fatty acyl-CoA)進(jìn)入線粒體氧化供能。

綜上，缺氧可以刺激心肌自分泌MIF，MIF經(jīng)跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)引起AMPK磷酸化，活化的AMPK促進(jìn)脂肪酸代謝，加強(qiáng)氧化供能，為缺氧提供代償性保護(hù)。我們的研究只靜態(tài)地觀測了一個時間點(diǎn)，對心肌缺氧后能量代謝進(jìn)行了初步框架性研究，其動態(tài)過程還有待今后深入探究。

4 結(jié) 論

采用體外心肌細(xì)胞缺氧模型及MIF阻斷法證明，缺氧可以刺激心肌自分泌MIF，MIF經(jīng)跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)引起AMPK磷酸化，活化的AMPK促進(jìn)脂肪酸代謝，為缺氧心肌提供代償性能量供應(yīng)。

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