王紅娜，孫洪新，張英杰*，劉月琴，谷振慧，史秀芬

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，保定 071000； 2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，保定 071000)

肌肉生長抑制素(Myostatin, MSTN)，又稱之為GDF-8，屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)超家族成員，是能夠在骨骼肌中特異表達的一類糖蛋白，負向調(diào)控肌肉的生長和發(fā)育[1]。生肌過程是一個復(fù)雜的過程，在早期胚胎中來自于生肌節(jié)區(qū)的中胚層細胞轉(zhuǎn)移至胚性結(jié)締組織附近，生成骨骼肌成肌細胞。成肌細胞增殖后，彼此融合分化形成多核的肌纖維[2]。

生肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)家族，包括生肌決定因子(Myogenic factor 5, Myf5)、成肌分化因子 (Myogenic differentiation antigen, MyoD)、肌細胞生成素(Myogenin, MyoG)和Myf6即肌調(diào)節(jié)因子4(Muscle regulatory factor 4, MRF4)等4個轉(zhuǎn)錄因子，參與骨骼肌生成過程中分子調(diào)控機制，啟動和維持骨骼肌細胞分化發(fā)育和生長[3]。研究發(fā)現(xiàn)，Myf5和MyoD可以使成肌細胞定型[4]，而MyoG和Myf6在成肌細胞的融合和分化中起作用[5]。細胞周期抑制因子(p21)與細胞增殖密切相關(guān)。羥酰基輔酶A脫氫酶1(Hydroxyacyl CoA dehydratase 1,HACD1)是細胞膜組成和流動的調(diào)節(jié)因子，在肌肉發(fā)育和再生中促進成肌細胞融合[6]。

以往的報道大多集中研究干擾MSTN后相關(guān)基因的表達[7-11]，本試驗通過腺病毒介導(dǎo)shRNA干擾綿羊成肌細胞MSTN，研究MSTN基因?qū)d羊成肌細胞增殖和分化的影響，探討其作用機制，確定綿羊MSTN基因與p21基因在增殖中的表達調(diào)控關(guān)系，及其與生肌調(diào)節(jié)因子家族MRFs和HACD1基因在分化過程中的表達調(diào)控關(guān)系，為深入了解MSTN基因?qū)d羊肌肉生長發(fā)育的作用及其調(diào)控機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

小尾寒羊成肌細胞由本實驗室分離純化[12]，shRNA重組腺病毒陰性對照載體NC和干擾載體Sh3+4按文獻[13]所示方法構(gòu)建，由本實驗室保存(經(jīng)qRT-PCR檢測干擾效率達到72%，經(jīng)Western blot檢測干擾效率達到54%)，胎牛血清(FBS)、DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、DPBS 緩沖液、青鏈霉素混合液(100×)購自BI公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript?RT)購自寶生物工程(大連)有限公司，Bestar SybrGreen qPCR Mastermix購自德國DBI公司。

1.2 成肌細胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

成肌細胞為本實驗室凍存的第2代細胞，解凍后用培養(yǎng)液(90%DMEM/F12+10%FBS)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h，將細胞接種到培養(yǎng)板中，使轉(zhuǎn)染時細胞密度達到80%左右。陰性對照載體NC、干擾載體Sh3+4腺病毒用培養(yǎng)液稀釋100倍轉(zhuǎn)染細胞，6孔培養(yǎng)板中每孔加入1 mL病毒稀釋液。感染5 h后進行換液，24 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞生長狀況及綠色熒光蛋白表達情況。

1.3 成肌細胞的增殖

1.3.1 CCK-8檢測成肌細胞增殖 成肌細胞感染腺病毒2 d后，利用0.25%胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，96孔板每孔加入2 000個細胞，重復(fù)3孔，每天在同一時間點取出培養(yǎng)板進行檢測，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2.5 h，在酶標儀震蕩后以450 nm波長測定吸光度，連續(xù)測定7 d，繪制細胞生長曲線。

1.3.2 流式細胞儀(PI染色法)檢測細胞周期 成肌細胞感染腺病毒2 d后，用不含EDTA的胰酶消化細胞制成單細胞懸液，1 000 r·min-1離心5 min，去上清液。用預(yù)冷的PBS洗細胞2次，加入預(yù)冷的70%乙醇，于4℃固定過夜。離心棄上清，用PBS洗1次，加入500 μL的PI/RNase溶液重懸，避光室溫孵育15 min。每組3個重復(fù)。FACS Calibur流式細胞儀采用ModFit LT 軟件進行細胞 DNA 含量分析。

1.3.3 qRT-PCR檢測p21基因的表達 成肌細胞感染病毒48 h后，熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況，收集細胞，用Trizol法提取各組細胞總RNA，電泳檢測質(zhì)量，Nanodrop 2000 超微量分光光度計定量后，按照TaKaRa(PrimeScriptTMRT Reagent Kit)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作程序進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，再以cDNA為模板，采用SYBR GreenI法進行qRT-PCR測定，每組3個重復(fù)。PCR反應(yīng)體系：SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL，正、反向引物各0.5 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O加至 20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸60 s并收集熒光信號，共40個循環(huán)；熔解曲線分析：95 ℃15 s，60～95 ℃，0.3 ℃·s-1生成熔解曲線。以GAPDH為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法進行相對定量計算，每個樣品重復(fù)3次，取平均值。

1.4 成肌細胞的分化

1.4.1 成肌細胞融合率測定 將感染腺病毒2 d的細胞接種到細胞爬片，用2%馬血清誘導(dǎo)分化到第3天，進行細胞免疫組化染色。PBS清洗標本3次，每次2 min；用4%多聚甲醛固定細胞15 min，0.3% TritonX-100穿孔20 min，3%雙氧水孵育5 min，10% 驢血清37 ℃封閉20 min，滴加一抗MYH1(1∶200稀釋度)4 ℃過夜。PBS 緩沖液洗 3 次。滴加PV-6000，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5 min；DAB顯色，DAPI染色 3 min。熒光顯微鏡下觀察染色后的肌管形態(tài)，隨機選取3個視野，使用 NIS-Elements(Nikon)軟件計量視野內(nèi)融合到多核細胞內(nèi)的細胞核的數(shù)目，除以整個視野中細胞核數(shù)目，計算其百分數(shù)即為細胞融合率。

1.4.2 qRT-PCR檢測成肌細胞分化后相關(guān)基因的表達 成肌細胞感染腺病毒2 d后，換含2%馬血清的培養(yǎng)基對成肌細胞進行誘導(dǎo)分化，分別于誘導(dǎo)分化后的48、72、96 h收集細胞，提取RNA。測定MSTN、MyoD、MyoG、Myf5、Myf6和HACD1基因的表達情況。引物序列見表1。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPASS19.0統(tǒng)計軟件進行分析，組間比較利用單因素方差獨立樣本t檢驗進行方差分析和顯著性檢驗。試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 干擾MSTN后對綿羊成肌細胞增殖的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示(圖1)，培養(yǎng)1～3 d兩組OD值幾乎相同，細胞活性無顯著性差異(P>0.05)，但在第3天后干擾組細胞生長明顯減緩，第4天時OD值比陰性對照組低(19.3±0.04)%，第5天時低(38.2±0.03)%，第6天時低(44.3±0.03)%，第7天時低(21.9±0.12)%，差異均達到顯著水平(P<0.05)，第6 天為極顯著(P<0.01)，說明干擾MSTN后成肌細胞增殖能力降低。

2.2 干擾MSTN后對綿羊成肌細胞周期的影響

成肌細胞感染腺病毒48 h后進行細胞周期檢測(圖2，表2)，相對于陰性對照組，干擾組處于G0/G1期細胞的比例顯著增加(P<0.05)，而S期細胞所占的比例顯著下降(P<0.05)。表明干擾內(nèi)源性MSTN后抑制綿羊成肌細胞增殖。

2.3 干擾MSTN后qRT-PCR檢測綿羊p21基因的表達

干擾MSTN后p21基因的表達見圖3，結(jié)果表明，Sh3+4干擾組較陰性對照組p21的mRNA表達量升高了1.42倍，達到極顯著水平(P<0.01)。

2.4 綿羊成肌細胞誘導(dǎo)分化后MSTN基因表達

成肌細胞經(jīng)重組腺病毒感染后進行誘導(dǎo)分化，在誘導(dǎo)48～96 h時，相較于陰性對照，干擾組Sh3+4細胞的MSTN基因表達量均極顯著減少(P<0.01，圖4)，96 h時達到最低值，僅為對照組細胞的10%，達到極顯著水平(P<0.01)，表明Sh3+4腺病毒對MSTN表達進行了持續(xù)有效的干擾。

表1基因引物參數(shù)

Table1Parametersofprimerpairsforthegenes

基因Gene參考序列Accessionnumber引物序列(5'-3')Primersequence產(chǎn)物大小/bpProductsize退火溫度/℃TmMSTNNM_001009428F:GGCTCCTTGGAAGACGATR:CAGTTGGGCCTTTACTACTTTAT15960MyoDNM_001009390F:AGGGTCCCTCGCGCCCAAAAGR:TGCGGGAGGCGGAAACACAACAGT12262Myf5XM_004006219.1F:ACCAGCCCCACCTCAAGTTGR:GCAATCCAAGCTGGATAAGGAG15060Myf6(MRF4)NM_001134782.1F:GCTACAGACCCAAGCAGGAAR:CGAGGCCGATGAATCAATGC14360MyoGNM_001174109.1F:AGGTGAATGAAGCCTTCGAGR:TCCTGGTTGAGGGAGCTGAG13960HACD1NM_001009443F:CATTTGCCTTGCTTGAGATAGTCR:GCACCACACTCTCCTCATTCT15860p21XM_004014151.1F:CACTGCCAACAGGCCGAAGCR:TGGAGCGGGTCACGGAGATG15060GAPDHNM_001190390.1F:CTGACCTGCCGCCTGGAGAAAR:GTAGAAGAGTGAGTGTCGCTGTT14960

與對照組相比，**表示差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)。下同Compared with the negative control group, ** indicate extremely significant difference (P<0.01)，* indicate significant difference (P<0.05). The same as below圖1 成肌細胞生長曲線Fig.1 The growth curve of myoblast cells

表2干擾MSTN后細胞周期變化

Table 2 The cell cycle alteration after MSTN interfered %

A. NC; B. Sh3+4圖2 流式細胞圖Fig.2 Flow cytometry

圖3 干擾MSTN后p21基因的表達Fig.3 The expression of p21 after of MSTN interfered

2.5 干擾MSTN對綿羊成肌細胞融合的影響

腺病毒干擾載體感染的成肌細胞在含2%馬血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，第3 天后顯微鏡下觀察，當細胞匯合度達到80%時，相鄰成肌細胞靠攏，由長梭形變得細長，呈平行排列走向，細胞膜模糊，含多個細胞核，呈現(xiàn)出長條管狀結(jié)構(gòu)，即肌小管。進行免疫細胞化學(xué)染色(圖5)，測定分化指標肌管融合率，相對于陰性對照組，Sh3+4干擾組肌管融合率增加了43.6%,達到極顯著水平(P<0.01，圖6)。

圖4 成肌細胞分化后MSTN基因的表達Fig.4 The expression of MSTN gene after myoblast differentiating

2.6 綿羊成肌細胞誘導(dǎo)分化后相關(guān)基因的表達變化

qRT-PCR檢測生肌調(diào)節(jié)因子及細胞融合相關(guān)基因HACD1的mRNA表達水平見圖7。Sh3+4干擾組與NC陰性對照組相比，誘導(dǎo)48 h后 4個生肌調(diào)節(jié)因子表達量均呈下降趨勢，MyoG基因達到顯著水平(P<0.05)；誘導(dǎo)72 h后Myf5和Myf6基因表達量極顯著降低(P<0.01)，MyoD基因表達量升高不顯著(P>0.05)，MyoG基因極顯著增加(P<0.01)，說明此時與陰性對照組相比在Sh3+4干擾組有更多的成肌細胞融合為肌管；誘導(dǎo)96 h，Myf5基因表達量顯著降低(P<0.05)，MyoD基因表達量降低不顯著(P>0.05)，MyoG基因表達量極顯著降低(P<0.01)，Myf6基因表達量升高不顯著(P>0.05)。另外誘導(dǎo)72 h，HACD1基因的表達量在干擾組中顯著高于陰性對照組(P<0.05)，誘導(dǎo)48和96 h無顯著變化，證實了該基因與成肌細胞融合相關(guān)。

A.陰性對照(NC)組免疫細胞化學(xué)染色；B.陰性對照(NC)組DAPI核染；C. Sh3+4干擾組免疫細胞化學(xué)染色；D. Sh3+4干擾組DAPI核染A.Negative control group (NC) stained by immunocytochemistry; B. Negative control group (NC) stained by DAPI; C. Interference group Sh3+4 stained by immunocytochemistry; D. Interference group Sh3+4 stained by DAPI圖5 成肌細胞分化 72 h 后 MYH1 免疫細胞化學(xué)結(jié)果(100×)Fig.5 Myoblasts stained with anti-MYH1 antibody at 72 h in differentiation medium (100×)

圖6 成肌細胞肌管融合率Fig.6 Myotube fusion rate of myoblast

3 討 論

肌肉質(zhì)量的增加包括肌纖維增生和肥大，該過程包括成肌細胞的增殖和分化。早期肌肉祖細胞被特化，退出細胞周期，最終分化成肌纖維[14]。深入了解分化過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，進一步探索肌肉的生長發(fā)育機制對提升家畜動物的產(chǎn)肉性能具有十分重要的意義。大多數(shù)報道認為，MSTN負調(diào)控肌源性細胞的增殖[15-19]，但D.Joulia等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，抑制C2C12成肌細胞內(nèi)源性MSTN后增強了細胞周期的退出從而刺激細胞分化。B.D.Rodgers等[21]對C2C12的研究發(fā)現(xiàn)，MSTN對細胞的生長有激活作用。MSTN在肌源性細胞分化中的作用也存在爭議，一些研究證明，在不同的物種中其對成肌細胞的分化有抑制作用[16, 22-24]，而其他研究發(fā)現(xiàn)MSTN對肌源性細胞的分化有刺激促進作用[25-28]。本試驗通過腺病毒介導(dǎo)shRNA抑制內(nèi)源性MSTN后，研究成肌細胞的增殖和分化，結(jié)果并未觀察到干擾MSTN基因促進成肌細胞的增殖，生長曲線第3天后反而顯示增殖能力降低。此結(jié)果與p21基因表達升高，細胞生長周期停滯在G0/G1的結(jié)果吻合。p21是細胞周期抑制因子基因，該基因的上調(diào)可抑制 cyclin-Cdk 復(fù)活物活力，使 Rb 蛋白不能磷酸化而呈現(xiàn)低磷酸化狀態(tài)。S 期基因表達所必需的轉(zhuǎn)錄因子(E2F-DP1)不能釋放，細胞停滯在 G1 期，從而導(dǎo)致成肌細胞增殖抑制，數(shù)量減少。干擾MSTN后抑制成肌細胞生長的結(jié)果與大多數(shù)報道不一致的原因：一可能是本研究采用的是綿羊成肌細胞，以往報道多集中在小鼠、山羊等物種；二可能是本研究采用的RNA干擾介導(dǎo)載體為腺病毒，以往大多采用siRNA、質(zhì)粒或是慢病毒載體；三可能是在生長后期干擾組成肌細胞被觸發(fā)分化而抑制增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，干擾MSTN基因后成肌細胞的融合率顯著增加，與大多數(shù)報道一致。因此MSTN對成肌細胞增殖及分化的確切作用有待進一步驗證。

圖7 成肌細胞誘導(dǎo)分化后調(diào)控基因的表達Fig.7 Regulatory genes expression after myoblasts differentiating

本試驗檢測了成肌細胞誘導(dǎo)分化后參與肌肉分化的生肌調(diào)節(jié)因子Myf5、MyoD、MyoG和Myf6基因表達的變化，這些因子的時序表達對于確定肌源性是必需的，Myf5在靜止和激活的衛(wèi)星細胞中表達，MyoD和MyoG是下游分化因子，Myf6在肌管成熟過程中起作用[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)72 h時MyoD和MyoG基因的表達量在干擾組比陰性對照組高，同時還發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)72 h時，肌管有大量的融合，在干擾組中有更多的肌細胞生成肌管，表明抑制MSTN基因后對細胞的分化起到了促進作用。此前W.Luo等[30]的研究證實MyoD和MyoG通過結(jié)合到Myomaker啟動子上促進成肌細胞分化。本研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)72 h時，Myf5基因的表達量在干擾組比對照組低，進一步證實了Myf5是成肌細胞早期表達的基因，可能不參與肌管形成的末期。誘導(dǎo)96 h時，Myf6基因的表達量在干擾組比陰性對照組高，暗示在干擾組中有更多的肌纖維形成，也進一步說明了Myf6在肌管成熟后期起作用。本研究進一步證實，相關(guān)基因在分化過程中依照Myf5、MyoD、MyoG和Myf6的順序依次表達。

本研究檢測了與細胞融合相關(guān)的HACD1基因，HACD1基因是膜組成和流動性的調(diào)節(jié)因子，在72 h時干擾組肌管融合率極顯著高于陰性對照組，并且HACD1基因表達量顯著高于對照組，證實了該基因與成肌細胞融合密切相關(guān)，此結(jié)果與J.Blondelle等[6]的研究結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

本研究證實MSTN對成肌細胞增殖有促進作用，對成肌細胞的分化融合有抑制作用。確定了在成肌細胞分化過程中MSTN基因與Myf5、MyoD、MyoG和Myf6的表達調(diào)控關(guān)系。進一步證實HACD1基因與成肌細胞融合相關(guān)。本研究為深入揭示MSTN基因?qū)d羊肌肉生長發(fā)育的作用及其調(diào)控機制奠定了理論基礎(chǔ)。

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