郭振華，陳鑫鑫，李 睿，喬松林，郭軍慶，張改平,2*

(1.河南省農業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室 農業(yè)部動物免疫學重點實驗室，鄭州 450002；2.河南農業(yè)大學，鄭州 450002)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)于1987年在美國首次報道，隨后歐洲(德國、荷蘭等)和亞洲(日本、中國)等地區(qū)陸續(xù)報道了本病的發(fā)生[1]。1991年荷蘭學者Terpstra和美國學者Collins先后分離和確定了本病的病原為一種帶囊膜的病毒，后來將這種導致豬繁殖與呼吸綜合征的病毒統(tǒng)一稱為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS virus，PRRSV)[2]。PRRSV為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于套式病毒目(Nidovirales)，動脈炎病毒科(Arteriviridae)，同屬于本科的病毒還包括馬動脈炎病毒(equine arteritis virus，EAV)、乳酸脫氫酶增高病毒(lactate dehydrogenase-elevating virus，LDV)和猴出血熱病毒(simian hemorrhagic fever virus，SHFV)。PRRSV基因組大小約15 kb，包含至少12個開放閱讀框，從5′端到3′端依次為5′UTR-ORF1a(ORF1a′-TF)-ORF1b-ORF2a-ORF2b-ORF3-ORF4-ORF5/ORF5a-ORF6-ORF7-3′UTR；在病毒自身編碼的蛋白酶——Nsp1α、Nsp1β、Nsp2、Nsp4的剪切作用下，編碼產生至少16個非結構蛋白和8個結構蛋白[3]。

目前，PRRSV分為兩個基因型——genotype 1和genotype 2。Genotype 1也稱為歐洲型(European type)，代表性毒株為Lelystad Virus,genotype 2也稱為美洲型(North American type)，代表性毒株為ATCC VR2332。兩種基因型的核苷酸相似性在55%～70%，氨基酸相似性在50%～80%[4]。PRRSV一個顯著的特點是基因組具有很高的遺傳多樣性。M. Shi等在分析了8 500余條genotype 2ORF5序列的基礎上，建立了全球genotype 2流行毒株的分類系統(tǒng)，將全球范圍內流行的毒株分為至少9個譜系(lineage 1～9)和37個亞譜系(sublineage)，為全球范圍內genotype 2 PRRSV流行毒株的遺傳多樣性和分子進化研究提供了很好的參考體系[5]；T. Stadejek等對歐洲PRRSV流行毒株的分子流行病學研究顯示，genotype 1至少可以分為3個亞型——subtype 1～3，每個亞型又可分為若干個譜系，subtype 1又稱為泛歐洲型(Pan-European types)，在歐洲和全球其他地區(qū)流行，subtype 2和subtype 3屬于東歐型(Eastern European types)，主要局限于東歐各國和俄羅斯地區(qū)流行；歐洲型毒株的一個顯著的特點是其N蛋白具有多態(tài)性，N蛋白編碼的氨基酸在124～132 aa不等，一般來說，subtype 1、subtype 2和subtype 3對應的N蛋白編碼長度分別為128 aa(偶見126/129/132 aa)、125 aa(偶見124/131 aa)、124 aa(偶見128 aa)[6]。N蛋白多態(tài)性的生物學意義還有待進一步的研究。

1 PRRSV在我國的發(fā)現

我國有關PRRS的描述最早見于1995年，隨后郭寶清等(1996年)、楊漢春等(1997年)、姜平等(1997年)學者先后分離確定了引起本次疫病流行的病原——PRRSV，代表性的分離毒株分別為CH-1a、BJ-4和J1，均為美洲型毒株[7-9]。關于我國PRRSV的來源并不十分清楚，陳博文等(1996年)從加拿大進口的種豬中成功分離到了PRRSV——CDJ9512毒株，提示我國的早期引種操作中存在PRRSV輸入性傳播的可能[10]，并且我國早期分離株BJ-4與美國早期流行毒株VR-2332的全基因組相似性為99.6%；關于歐洲型毒株的描述最早見于趙耘等(1999年)對B13毒株的相關研究，但對于B13的來源并沒有明確的文獻報道，僅顯示B13毒株是由大連動植物檢疫局保存饋贈[11]。總之，自1995年有明確報道以來，PRRSV在我國豬群中一直呈流行狀態(tài)，并不斷發(fā)生著廣泛的變異。2006年，以JXA1毒株為代表的高致病性毒株的出現，是我國PRRSV遺傳變異過程中一個標志性事件，高致病性毒株在致病性、遺傳多樣性方面均出現了很大的變化，雖然之后開發(fā)了相應的商品化疫苗，但一直未能改變我國PRRSV廣泛流行和PRRS廣泛發(fā)病的現狀，且新的變異毒株也不斷出現[12-15]。為更好地了解我國PRRSV的流行情況，基于已發(fā)表的相關文獻及GenBank數據庫中序列信息，我們選取了120株genotype 2和43株genotype 1的流行毒株及參考毒株，進行系統(tǒng)的分子流行病學分析，系統(tǒng)進化樹的構建(neighbor-joining method)和序列比對(clustal W method)均使用MEGA 6.0進行處理；基因組序列的同源性分析使用DNAstar-MegAlign(clustal W method)軟件進行分析處理。

2 美洲型PRRSV在我國的流行情況

基于genotype 2 PRRSV的全球流行毒株分類系統(tǒng)，參照已發(fā)表文獻及GenBank數據庫中的ORF5序列信息，我們選取了120株中國流行毒株及參考毒株序列，系統(tǒng)進化樹分析顯示(圖1)，我國的流行毒株總體分屬于四個譜系：lineage 1、lineage 3、lineage 5(sublineage 5.1)、lineage 8(sublineage 8.7)。其中sublineage 8.7是我國流行毒株的優(yōu)勢譜系，代表性毒株為經典毒株CH-1a和高致病性毒株JXA1等；其次是lineage 1譜系，2013年以來呈現快速的擴散和流行，代表性毒株為HENAN-XINX、JL580等[16-17]；Sublineage 5.1則是以經典毒株VR2332和BJ-4毒株為代表的譜系，雖然很早在我國就有流行，但是一直不是田間流行的優(yōu)勢毒株，其致病性也相對較弱；Lineage 3雖然也有流行，但是一直處于偶發(fā)的狀態(tài)，且流行區(qū)域有限，未在豬群中廣泛流行，代表性毒株有FJFS和QYYZ等[18-19]。

圖1 美洲型參考毒株基于ORF5基因的進化樹分析Fig.1 The phylogenetic assay of North American genotype 2 based on ORF5 gene sequence

2.1 Lineage 8在我國的流行

Sublineage 8.7是我國PRRSV的優(yōu)勢流行譜系，其代表性毒株CH-1a是我國最早分離的PRRSV毒株，全基因組序列同源性分析顯示，CH-1a與美洲早期分離毒株JA142和SDSU73(均屬于sublineage 8.9)相似性為94.5%，而與VR2332(sublineage 5.1)的相似性為91.5%。根據我國流行的sublineage 8.7譜系的ORF5基因序列的遺傳進化分析，sublineage 8.7又可以分為五個亞群——subgroupⅠ～Ⅴ。SubgroupⅠ以早期分離毒株CH-1a為代表，是與我國最早分離毒株遺傳關系最為接近的一個群體；SubgroupⅡ是我國PRRSV由經典毒株向高致病性毒株演化過程中的一個過渡群體，其代表性毒株BJ0706和NB-04與CH-1a和JXA1的全基因組核酸相似性分別為95.1%～95.8%和97.1%～98%，且非結構蛋白Nsp2上481位首次出現了1個氨基酸的缺失[20]。而subgroupⅢ～Ⅴ主要是高致病性毒株及疫苗衍生毒株。2006年，PRRS疫情首先從我國南方地區(qū)暴發(fā)，隨后疫情迅速在全國范圍內傳播，田克恭(K. G. Tian)等確定了本次疫情是由PRRSV突變株——高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(highly pathogenic PRRSV，HP-PRRSV)引起，基因組序列分析顯示，HP-PRRSV具有獨特的分子標志，其Nsp2蛋白存在不連續(xù)的30 aa(481 aa+533～561 aa)的缺失[12]。代表性毒株JXA1、TJ、HuN4與經典毒株CH-1a的全基因組相似性約為95.3%，而與BJ-4的全基因組相似性約為89.6%，目前比較一致的觀點是HP-PRRSV是由我國CH-1a-like毒株在流行過程中不斷變異而產生的[5]。HP-PRRSV自2006年在我國出現流行以來，其遺傳多樣性在不斷增大，表現出不同的進化關系，subgroupⅢ主要是與JXA1遺傳關系更近的亞群，稱為JXA1-like亞群；SubgroupⅣ主要是和TJ、HuN4遺傳關系更近的亞群；SubgroupⅤ則是與高致病毒株制備的弱毒疫苗(JXA1-P80)遺傳關系更近的亞群，稱為HP-PRRSV vaccine-like亞群[21]，因為缺少TJM-F92和HuN4-F112疫苗毒株的序列信息，所以無法確定二者是否也存在類弱毒疫苗的亞群。根據目前PRRSV弱毒疫苗特點，疫苗的大量使用產生類疫苗的亞群是一個必然的結果。

2.2 Lineage 5和lineage 3在我國的流行

Sublineage 5.1在我國存在的時間也很長，但是臨床檢出率卻并不高，特別是HP-PRRSV在我國流行以來，屬于sublineage 5.1的PRRSV毒株流行率很低，代表性毒株BJ-4在1997年由楊漢春等分離得到。全基因組序列同源性分析顯示，BJ-4與VR2322和RespPRRS MLV(Boehringer Ingelheim, Germany)的相似性分別為99.6%和99.8%，提示BJ-4極有可能是早期北美地區(qū)流行毒株的輸入性感染或者疫苗衍生的毒株。Lineage 3在我國出現的時間相對較晚，最初認為是一個新的譜系(novel lineage)，后來基于美洲型PRRSV全球分類系統(tǒng)，發(fā)現屬于lineage 3[19-20]，代表性毒株GM2和QYYZ與VR2332、CH-1a、BJ-4、JXA1的全基因組相似性在86.2%～88.7%，臨床檢出率很低，主要局限在福建、廣東地區(qū)流行。

2.3 Lineage 1在我國的流行

Lineage 1是最近在我國豬群中新流行的一個譜系，2013以來，PRRS在我國豬群中呈現再度流行的趨勢，一些穩(wěn)定的豬場出現母豬的流產和保育豬嚴重的呼吸道疾病，現有的商品化疫苗免疫后基本無臨床保護效果。周峰等首先描述了這一類毒株在河南省豬群中的存在，發(fā)現這一類毒株的Nsp2基因存在不連續(xù)的393個核苷酸(131 aa)的缺失[16]；2014—2015年，這類毒株迅速在我國豬群中流行擴散開來，北京、天津、黑龍江、吉林、山西、安徽、湖南、浙江、福建等10余個地區(qū)省份均報道了本類毒株的流行[15, 22-23]。目前，NADC30-like毒株在河南地區(qū)的臨床檢出率在50%左右[24]。代表性毒株HENAN-XINX和JL580的全基因組序列與美國2001年分離株MN184A的相似性為86.7%～87.8%，與2008年分離株NADC30的相似性為92.8%～95.4%，與CH-1a、BJ-4、JXA1、QYYZ的相似性在82.2%～87.2%，同時與MN184A和NADC30一樣，其非結構蛋白Nsp2均存在不連續(xù)的131 aa的標志性缺失。因此將這一類毒株統(tǒng)稱為NADC30-like毒株或者類NADC30毒株，并明確了NADC30-like毒株的出現和流行是我國2013年以來PRRS再度流行的主要原因。目前比較一致的觀點是NADC30-like毒株很有可能是通過種豬貿易從北美地區(qū)輸入到我國的[17,23]，并且在我國豬群中發(fā)生了較大的遺傳變異，和我國流行毒株發(fā)生了廣泛的基因重組，包括和經典毒株重組的毒株，如HNyc15、Chsx1401[15,25]；和高致病性毒株重組的毒株，如JL580、FJ1402[17,26]；和弱毒疫苗毒株重組毒株，如FJW05、TJnh1501[19,27]。不同毒株的臨床致病性呈現較大的差異，整體上分為兩大類——即與高致病性毒株相當的，如JL580毒株和FJ1402毒株[17,26]；或者低于高致病性毒株，屬于中等毒力的毒株，如HNjz15毒株和CHsx1401毒株[28-29]；NADC30是一個中等毒力的毒株，為何在我國呈現如此大的毒力差異性，比較合理的解釋是NADC30和我國流行毒株發(fā)生了廣泛的基因重組，不同毒株的不同基因片段的插入，賦予了新毒株不同的生物學特性，比如致病力或者關鍵抗原的改變等。

3 歐洲型PRRSV在我國的流行情況

3.1 臨床流行情況

因為臨床檢出率很低，有關歐洲型毒株的流行情況、遺傳變異情況和致病力等方面的研究也相對較少。我國關于歐洲型毒株的最早描述見于1999年，趙耘等對B13毒株的ORF5基因進行了克隆和序列分析，但是對于B13的來源依然不清楚，文獻中僅顯示該毒株由大連動植物檢疫局保存饋贈[13]，從其與歐洲型代表毒株Lelystad virus的ORF5基因的相似性來看(99.7%，僅有兩個核苷酸的不同)，該毒株很可能是由早期進口的種豬中分離或者來自于相關國家作為標準毒株的饋贈。N. H. Chen等對我國歐洲型毒株流行情況的調查顯示，最早可以從2006年保存的病料中檢測到歐洲型毒株的存在[30]，之后Z. Zhou等、J. K. Liu等研究者也相繼報道了歐洲型毒株在其他地區(qū)的流行，目前主要存在于內蒙古、北京、福建、貴州和香港等地區(qū)，豬場陽性率在5%左右[31-32]。目前關于我國歐洲型流行毒株的研究主要還集中在分子流行病學層面，對于不同毒株的致病性、引起機體免疫應答的情況、疫苗的保護效果等，還缺少系統(tǒng)的深入研究。X. C. Wang等評估了GZ11-G1株對仔豬的致病性，發(fā)現其可以引起仔豬發(fā)熱、高的病毒血癥和肺部、淋巴結的損傷等[33]。

3.2 基于ORF5的遺傳進化及多樣性分析

基于ORF5序列的遺傳進化分析顯示，我國流行的歐洲型毒株均屬于subtype 1，即泛歐洲型(Pan-European)，目前尚未發(fā)現東歐型subtype 2和subtype 3。我國流行毒株根據其進化分支，又大致可以分為3個亞群:subgroupⅠ～Ⅲ(圖2)。全基因組序列分析顯示，我國流行毒株與Lelystad virus的相似性在85.9%～92.7%，我國本土流行的毒株序列相似性在82.7%～93.8%，不同毒株間的遺傳差異很明顯；需要注意的是，SHE株為實驗室構建毒株，是從Amervac PRRS 疫苗毒株拯救的感染性克隆，而NVDC-FJ、NVDC-NM2、NVDC-NM3彼此間的相似性在99.6%以上，提示這三株可能是在同一豬場同一病例中分離得到的。ORF5序列分析顯示，我國流行毒株核酸序列相似性為81.7%～98%，我國流行毒株與Lelystade virusORF5的核酸序列相似性為83.5%～99.7%。與Lelystade virus序列相比，第8、56、60、63、106位氨基酸屬于高變異的氨基酸位點，每個位點都有3～7種氨基酸的突變存在，且主要分布在信號肽區(qū)和高突變區(qū)；而37位(N/DLV)、100位(V/TLV)、101位(T/ALV)、112位(S/CLV)、123位(L/FLV)、155位(I/VLV)、173位(G/DLV)、175位(D/NLV)則發(fā)生了非常保守的突變，是中國流行毒株較為特異的突變位點(圖3)。

圖2 歐洲型參考毒株基于ORF5基因的進化樹分析Fig.2 The phylogenetic assay of European genotype 1 based on ORF5 gene sequence

1—32 aa為信號肽序列，33—67和89—110 aa為高變區(qū)。190—202 aa為ES13序列。高變區(qū)框線區(qū)域為潛在的N-糖基化位點?！啊瘛贝砀叨茸儺惖陌被嵛稽c，“*”代表中國流行株保守的突變位點The signal sequence (1-32 aa) and hypervariable domains (33-67 aa, 89-110 aa) were indicated (solid boxes); Potential N-glycosylation sites were shown in the boxes at hypervariable domains; “●” means the hypervariable mutation sites; “*” represents the conserved mutation sites in Chinese genotype 1 PRRSV圖3 Genotype 1 ORF5蛋白氨基酸序列比對結果Fig.3 The alligment result of ORF5 amino acid sequence of genotype 1

3.3 N蛋白的多態(tài)性分析

如圖4所示，N蛋白一般認為是一個高度保守的蛋白，其N端(1～57 aa)主要與RNA的結合有關，其C端主要與核衣殼的形成相關。Genotype 1和genotype 2的N蛋白長度分別為128和123 aa，隨后的研究顯示，genotype 1的N蛋白在長度上具有較大的差異性，其氨基酸長度在124～132 aa[6]。N蛋白序列分析顯示，我國流行毒株的N蛋白氨基酸相似性86%～99.2%，N蛋白長度為128 aa，除了NVDC-NM2毒株外，其N蛋白長度為129 aa，在87位氨基酸之后插入了一個絲氨酸，這與subtype 1的N蛋白長度一致。與Lelystade virus毒株相比，我國流行毒株的第13(N/SLV)、100(G/SLV)、128(N/SLV)位氨基酸發(fā)生了較為保守的突變，N蛋白的序列和長度多態(tài)性的生物學意義有待進一步的研究。

4 小結與展望

本文從分子流行病學的角度分析了我國PRRSV的流行歷史及現狀。我國同時存在genotype 1和genotype 2兩種基因型的流行，genotype 2是田間主要流行的基因型。我國PRRSV流行之初，毒株就呈現較大的遺傳差異性，如CH-1a屬于sublineage 8.7，而BJ-4則屬于sublineage 5.1，且BJ-4與北美流行毒株VR2332的全基因組序列相似性為99.6%，提示BJ-4可能是來自北美的輸入性毒株。目前我國美洲型田間流行毒株分屬于4個譜系，lineage 1、lineage 3、lineage 5和lineage 8，其中l(wèi)ineage 1(NADC30-like)和lineage 8(HP-PRRSV)是當前田間主要的流行毒株，現有疫苗針對NADC30-like毒株的臨床保護效果很差，僅能提供有限的或者部分保護，雖然可以降低病毒血癥和縮短排毒時間，但是從臨床表現來看免疫組和未免疫組沒有顯著的差異[28,34]。我國已有9個以上的省市報道了歐洲型毒株的流行，目前分離株均屬于subtype 1，通過對GP5蛋白和N蛋白的序列分析，發(fā)現了我國流行毒株特有的氨基酸突變位點，考慮到目前我國還沒有針對歐洲型毒株的疫苗，因此需要格外關注歐洲型毒株的流行，做好臨床監(jiān)測工作。

A2—12、B25—30、C40—46、D51—67、D80—90為N蛋白上的抗原表位；E50—58、E64—72、E105—113、E113—121表示N蛋白上4個T細胞抗原表位；“Δ”表示插入氨基酸的位置；“*”表示中國流行株N蛋白保守的突變位點A2-12, B25-30, C40-46, D51-67 and D80-90 represent known epitopes in N protein; E50-58, E64-72,E105-113 and E113-121 indicate four porcine T-cell epitopes; “Δ” means the insertion site of amino acid; “*”represents the conserved mutation sites in Chinese genotype 1 PRRSV圖4 Genotype 1 N蛋白氨基酸序列比對結果Fig.4 The alligment result of N protein amino acid sequence of genotype 1

從美國1987年首次報道PRRS以來，PRRSV在世界范圍內的流行已接近30年，最初我們將其稱為神秘豬病(mystery swine disease，MSD)，30年來，雖然我們對PRRSV的臨床發(fā)病特點、分子流行病學、復制增殖的過程、致病機制、誘導機體產生免疫應答的機制和免疫逃逸機制有了很深的認識，也開發(fā)出了一系列的疫苗，但離我們最終控制該病還相距甚遠，臨床發(fā)病率也沒有明顯的改善，可以說PRRSV對我們來說依然是“神秘的”。我們依然有許多問題要進一步探究，如：1)PRRSV基因組發(fā)生高突變和高重組事件的分子機制是什么？2)PRRSV廣譜性的中和抗原和中和抗原表位有待進一步的解析。3)決定不同毒株毒力差異的分子機制有待進一步闡明。4)尋求新的疫苗開發(fā)策略，能否獲得安全、高效、對不同毒株具有廣譜保護性的疫苗等。這些問題的進一步闡明將為PRRSV的最終控制提供極大的幫助和支撐。

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