王子喬，張雪茜，孟凡榮，劉 喆

（天津醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗學院，天津300070)

肺癌占全世界腫瘤發(fā)病率的12.7%、死亡率的18.2%，是目前最常見的引發(fā)死亡的疾病之一[1]。在臨床和組織病理學上，肺癌分為兩大類，小細胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）。小細胞肺癌大約占肺癌的20%，而更具有腫瘤異質性的非小細胞肺癌大約占80%[2]。小細胞肺癌與非小細胞肺癌相比惡性程度較高，轉移早而廣泛，盡管小細胞肺癌對化療、放療敏感，但很快出現(xiàn)復發(fā)或病情進展[3]，目前尚無有效的靶向治療藥物，因此小細胞肺癌是研究腫瘤轉移很好的模型。由于人小細胞肺癌中腫瘤抑制基因Trp53和Rb1的高突變率，所以Trp53和Rb1基因的缺失可能為建立小鼠小細胞肺癌模型提供了合理的手段[4]，我們利用Cre-loxP系統(tǒng)來特異性敲除Trp53loxP/loxP；Rb1loxP/loxP小鼠肺上皮細胞中Rb1和Trp53，其Ad-Cre重組腺病毒是通過氣管插管來感染小鼠。因此體內氣道上皮和肺泡Ⅱ型細胞中敲除Rb1和Trp53，誘發(fā)小鼠的小細胞肺癌。

1 材料和方法

1.1 材料 Trp53loxP/loxP；Rb1loxP/loxP小鼠由中科院上海生化細胞研究所季紅斌教授饋贈,所用腺病毒Ad-Cre來自 VECTOR BIOLABS（The Gene Delivery Company，貨號 1045）。

1.2 試劑 PCR試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司。DAB顯色試劑購自北京中杉金橋。CgA抗體購自美國ABcam公司（貨號ab15160）。Cgrp抗體購自Milipore（貨號AB5920）。TTF-1抗體購自邁新試劑（貨號MAB-0599）。小鼠麻醉劑購自美國Sigma公司（貨號T48402）。

1.3 小鼠的鑒定 Trp53基因型鑒定引物：5′-CGCAATCCTTTATTCTGTTCG-3′，5′-AGCACATAG GAGGCAGAGAC-3′，5′-TGAGACAGGGTCTTGCTA TTG-3′。Rb1 基因型鑒定引物：5′-GAAAGGAAAGT CAGGGACATTGGG-3′，5′-GGCGTGTGCCATCAA TG-3′。

1.4 小鼠小細胞肺癌動物模型的建立 首先腹腔注射麻醉劑麻醉2月齡小鼠，再以Ad-CreCaPi（Ad-Cre CaPi：滴度為107PfU的Ad-Cre2μL加入到246.8μL的MEM中，再加入1.2μL的2mol/LCaCl2）的共沉淀物插管吸入小鼠氣管，每只小鼠吸入約100μL。病毒誘導7個月后收集死亡小鼠的肺、肝等組織進行石蠟包埋、切片、HE染色以及相關病理分析。

1.5 免疫組化檢測 通過對小鼠肺組織切片進行TTF-1、CgA、Cgrp等特異性標記蛋白的免疫組化染色，可確定腫瘤細胞是否表達 TTF-1、CgA、Cgrp，從而確定是否為小細胞肺癌。

2 結果

2.1 小鼠的鑒定 取小鼠尾部組織消化并提取基因組DNA，以基因組DNA為模板進行聚合酶鏈式反應，擴增得到Trp53loxP/loxP和WT對照小鼠的產物以及Rb1loxP/loxP和WT對照小鼠的產物，鑒定產物見圖1。

圖1 小鼠基因型鑒定Fig 1 PCR result of mouse genome DNA

2.2 小鼠小細胞肺癌模型的建立 17只Trp53loxP/loxP;Rb1loxP/loxP小鼠成功給予Ad-Cre病毒，病毒處理后小鼠質量逐漸降低，最終有11只（65%）小鼠造模成功。約7個月后，小鼠開始死亡，解剖死亡小鼠后肺部可觀察到大量結節(jié)，暗示肺部腫瘤的形成是小鼠致死的主要原因。肺癌發(fā)生小鼠肺部表型見圖2。

圖2 小鼠肺部形成結節(jié)（黑色箭頭所示為結節(jié)）Fig 2 Pulmonary nodules in mouse lung（Black arrow indicates pulmonary nodules）

2.3 小鼠肺組織切片病理染色 收集小鼠肺組織石蠟切片并進行HE染色，發(fā)現(xiàn)肺部有大量腫瘤灶的形成，且腫瘤細胞較小，擠壓變形，核漿比增大，呈現(xiàn)明顯的小細胞肺癌的特性。小鼠肺部切片HE染色結果見圖3。

A．小鼠肺組織HE染色顯示腫瘤形成；B.A圖區(qū)域放大。標尺：100μm圖3 小鼠肺組織切片HE染色Fig 3 Representative HE stain of lungs from mice

2.4 小鼠肺組織切片免疫組化染色 將上述腫瘤組織切片分別進行TTF-1、CgA、Cgrp免疫組化染色（圖4），發(fā)現(xiàn)在肺部腫瘤灶中TTF-1、CgA、Cgrp的表達水平顯著升高，大部分腫瘤細胞呈現(xiàn)TTF-1、CgA陽性以及Cgrp陽性，說明小鼠肺部腫瘤為小細胞肺癌。

圖4 小鼠肺組織TTF-1、CgA、Cgrp免疫組化染色Fig 4 IHCstainingwithanti-TTF-1,anti-CgA,anti-Cgrpperformed on lung tissues

2.5 小鼠小細胞肺癌模型的肝轉移 對死亡小鼠進行解剖分析，發(fā)現(xiàn)小鼠的肝組織上出現(xiàn)大量結節(jié)（圖5），通過石蠟切片及病理染色，肝組織中腫瘤細胞形態(tài)與肺部腫瘤細胞病理染色結果相似，說明小鼠肺部小細胞肺癌發(fā)生了肝轉移。

圖5 小鼠小細胞肺癌的肝轉移Fig 5 Liver metastasis of small cell lung cancer in mice

3 討論

肺癌是目前世界上致死率最高的主要疾病之一，它是一個龐大的疾病分類，包含了多種不同的表型以及遺傳突變，暗示著肺癌是一種高度異質性的疾病[5]。因此肺癌被分為多個不同的類型，其中最廣泛應用的分類是小細胞肺癌和非小細胞肺癌。非小細胞肺癌是肺癌中最常見的一種，又可以分為腺癌、鱗癌和大細胞肺癌[6]。小細胞肺癌約占所有肺癌中的15%，具有神經內分泌細胞的特性[1]。根據2004年世界衛(wèi)生組織的分類，小細胞肺癌是神經內分泌型肺癌的一種，代表了侵襲能力最高的一類肺癌[7]。在近10年中，對小細胞肺癌的治療仍然沒有新的手段，5年的生存率仍保持在7%以下?；蚪M學分析發(fā)現(xiàn)，在小細胞肺癌中存在多種重要基因突變，這些突變在小鼠小細胞肺癌模型中也得到了驗證[5]。為了給小細胞肺癌的臨床診治提供新的依據，加深對小細胞肺癌的起始、進展、轉移和抗藥性的細胞以及分子機制的理解顯得至關重要，但是到目前為止，仍然缺乏小細胞肺癌的小鼠模型。

由于人小細胞肺癌中腫瘤抑制基因Trp53和Rb1的高突變率，所以Trp53和Rb1基因的缺失可能為建立一個小鼠小細胞肺癌模型提供了合理的手段[4]。根據已有的研究，在小鼠神經內分泌型腫瘤的形成過程中，單獨缺失Rb1或者Trp53并不會引起細胞凋亡[8]，Rb1和Trp53是以一種協(xié)同作用的方式來發(fā)揮腫瘤抑制作用的，因此Rb1和Trp53的缺失是神經內分泌型腫瘤形成的先決條件[9]。

Trp53或Rb1缺失小鼠對于研究腫瘤進程有相當重要的價值，在小鼠肺組織中敲除Trp53會產生肺腺癌[10]。而Ad-Cre病毒誘導的Rb1在肺上皮中缺失直到第18個月都不會產生任何肺腫瘤，同時在這些小鼠中也不能檢測到神經內分泌細胞的異常增生。因此單獨的Rb1缺失并不足以誘導神經內分泌腫瘤的形成，進一步的腫瘤進程可能還需要抑制Trp53介導的細胞凋亡[9]。根據已有的報道，Rb1與Trp53同時缺失會使得人肺腺癌更易向小細胞肺癌轉化[11]。在本研究中，我們利用Trp53loxP/loxP;Rb1loxP/loxP小鼠，通過肺部氣管插管給予Ad-Cre重組腺病毒來誘導小鼠肺上皮細胞中Trp53以及Rb1的特異性缺失，從而建立了小鼠肺癌模型，并通過病理染色及TTF-1、CgA、Cgrp的免疫組化染色進一步確定了該肺癌模型為小細胞肺癌模型。

對肝組織的病理分析發(fā)現(xiàn)，小鼠肺組織的癌細胞已經擴散到肝臟等組織中，說明構建的小鼠小細胞肺癌模型具有高度侵襲性，也進一步證實了該小鼠小細胞肺癌模型[12]與人小細胞肺癌有高度的相似性，它也具有向其他功能器官，如腦、腎上腺、骨、卵巢轉移的潛能。該模型為研究小細胞肺癌的起始和早期提供了實驗工具，為臨床上小細胞肺癌化療策略以及化療藥物的篩選提供了實驗手段。

[1] Van Meerbeeck J P,Fennell D A,De Ruysscher D K.Small-cell lung cancer[J].Lancet,2011,378(9804):1741

[2] Rom W N,Hay J G,Lee T C,et al.Molecular and genetic aspects of lung cancer[J].Am J Respir Crit Care Med,2000,161(4 Pt 1):1355

[3] Fischer B,Arcaro A.Current status of clinical trials for small cell lung cancer[J].Rev Recent Clin Trials,2008,3(1):40

[4] Sattler M,Salgia R.Molecular and cellular biology of small cell lung cancer[J].Semin Oncol,2003,30(1):57

[5] Semenova E A,Nagel R,Berns A.Origins,genetic landscape,and emerging therapies of small cell lung cancer[J].Genes Dev,2015,29(14):1447

[6] Kamangar F,Dores G M,Anderson W F.Patterns of cancer incidence,mortality,and prevalence across five continents:defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world[J].J Clin Oncol,2006,24(14):2137

[7] Linnoila R I.Functional facets of the pulmonary neuroendocrine system[J].Lab Invest,2006,86(5):425

[8] Huun J,Lonning P E,Knappskog S.Effects of concomitant inactivation of p53 and pRb on response to doxorubicin treatment in breast cancer cell lines[J].Cell Death Discov,2017,3：17026

[9] Meuwissen R,Linn S C,Linnoila R I,et al.Induction of small cell lung cancer by somatic inactivation of both Trp53 and Rb1 in a conditional mouse model[J].Cancer Cell,2003,4(3):181

[10]Donehower L A.The p53-deficient mouse:a model for basic and applied cancer studies[J].Semin Cancer Biol,1996,7(5):269

[11]Lee J K,Lee J,Kim S,et al.Clonal history and genetic predictors of transformation into small -cell carcinomas from lung adenocarcinomas[J].J Clin Oncol,2017,12：JCO2016719096

[12]Abe R,Donnelly S C,Peng T,et al.Peripheral blood fibrocytes:differentiation pathway and migration to wound sites[J].J Immunol,2001,166(12):7556